生物標志物是指人體產生的某些生物分子，與正常狀態(tài)相比，在疾病發(fā)展或藥物治療過程中表達量或受影響的程度不同。開展臨床生物學標志物檢測涉及疾病早期篩查、鑒別診斷、藥物治療監(jiān)測及預后評估等疾病相關的各個環(huán)節(jié)。生物標志物的類型包括蛋白質、DNA、RNA 和代謝物等。其中，蛋白質生物標志物已經在治療和診斷的發(fā)展中發(fā)揮了既定的作用。比如，急性炎癥可以通過測量血液中C反應蛋白的水平來檢測，癌胚抗原（CEA）可以在一些患者中指示結腸癌的存在。對于一些疾病，如肌萎縮側索硬化癥（ALS），沒有測試可以提供明確的診斷，并且疾病癥狀與其它神經退行性疾病相似，蛋白質生物標志物有可能最終為患者提供答案。由于生物體的復雜多樣性，更多的情況下，單一或少量的生物標志物往往無法反映機體的真實狀態(tài)，更準確全面的評估需要結合更多生物標志物的檢測結果。
在發(fā)現(xiàn)潛在蛋白生物標志物之后，需要通過靶向蛋白組學定量技術在大生物樣本量中，進行高通量、高準確性、可重復性的檢測，來驗證這些標志物。目前，靶向蛋白定量檢測技術主要包括免疫分析和質譜分析。傳統(tǒng)的免疫法如ELISA，存在目標物通量低、靈敏度有限、交叉反應等不足，一些新型免疫檢測平臺則存在成本和技術門檻高、新方法開發(fā)周期長等問題。質譜靶向檢測主要包括基于三重四極桿的多反應監(jiān)測（MRM）和平行反應監(jiān)測（PRM）方法。與MRM相比，PRM的優(yōu)勢在于它可以通過單次掃描即可監(jiān)測目標母離子的所有產物離子，無需在數(shù)據(jù)采集之前預先設計母子離子對，簡化了方法開發(fā)工作流程，并且可提高檢測靈敏度。Heil等1在Orbitrap Eclipse質譜儀上多次測量126個血漿蛋白中的432個肽，在高分辨率Orbitrap和單位分辨率線性離子阱（LIT）之間交替進行分析，發(fā)現(xiàn)兩種質量分析器具有相似的技術精度，并且線性離子阱的優(yōu)越靈敏度使其在超過62%的肽中測得更低的定量下限。
圖1. Orbitrap與LIT PRM檢測對比
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2024年ASMS大會上，賽默飛推出全新產品Thermo Scientific™ Stellar™質譜儀。Stellar可通過四極桿和雙壓線性離子阱進行PRM分析；其雙離子阱結構允許同時進行離子積累和碎裂，可提高譜圖采集速率，增加樣本檢測通量；并且可進行MS3采集，克服復雜背景基質干擾。
圖2. 傳統(tǒng)三重四極質譜計與Stellar質譜對比
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下面我們一起來看看Stellar發(fā)布以來在靶向蛋白質組學方向的應用研究報道結果。
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Remes等2對比了血漿基質中786條多肽的三重四極桿和Stellar質譜靶向定量檢測結果，發(fā)現(xiàn)與MRM檢測結果相比，Stellar PRM檢測的定量下限（LOQ）和檢測下限（LOD）分別提高了~10倍和~2倍，展現(xiàn)出更高的靈敏度。
圖3. MRM和Stellar PRM檢測結果對比
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Plubell等3利用Orbitrap OE480或Stellar質譜建立基質樣本GPF-DIA蛋白組學譜圖庫；通過集成在skyline軟件中的PRM Conductor工具優(yōu)化每個precursor的色譜和質譜參數(shù)，以及篩選precursor的m/z和相對保留時間；利用引入Adaptive RT功能的Stellar質譜儀進行篩選后precursors的PRM檢測，開發(fā)了利用Stellar進行生物液體樣本高通量靶向蛋白檢測的方法（圖4）。在神經退行性疾病病人來源的腦脊液樣本中進行基于前期研究和GPF-DIA篩選得到的共101個蛋白（1070個precursors）的PRM檢測，通過Tau、APOE4等明確與AD相關的蛋白檢測結果驗證了實驗的可信度（圖5）；另外對病人血漿樣本進行直接基于GPF-DIA篩選得到的共723個蛋白（2096個precursors）的PRM檢測，并成功驗證出已報道的PD相關差異（圖6）。
圖4. 通過GPF-DIA建庫和PRM conductor篩選precursors建立Stellar高通量PRM分析方法的工作流程。
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圖5. 腦脊液樣本中神經退行性疾病相關蛋白的PRM測定結果。
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圖6. 建立富集血漿蛋白PRM檢測方法發(fā)現(xiàn)帕金森疾病相關差異。（點擊查看大圖）
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Wahle等4開發(fā)報道了基于Orbitrap Astral的DIA數(shù)據(jù)建立Stellar PRM方法的分析策略（圖7），以及利用15N標記蛋白在Stellar質譜上開發(fā)蛋白panel的準確定量方法（圖8），使包括翻譯后修飾和突變在內的蛋白質形態(tài)的研究成為可能，展示出Stellar在靶向蛋白質組學檢測方面的能力和潛力。
圖7. 基于Orbitrap Astral DIA數(shù)據(jù)建立Stellar靶向分析方法
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圖8. 酒精肝panel蛋白15N標記檢測
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小結
在蛋白質組學發(fā)現(xiàn)方面，Orbitrap Astral展示出強大的檢測通量和覆蓋深度，已經使開展大規(guī)模的臨床樣本檢測、發(fā)現(xiàn)新的潛在生物學標志物成為可能。但如何有效驗證和確認高分辨質譜揭示的成千上萬的候選標志物是目前實現(xiàn)生物標志物臨床轉化的難點，讓我們一起期待Stellar質譜在這一領域的精彩表現(xiàn)。
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