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細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒的使用方法

來(lái)源:上海力敏實(shí)業(yè)有限公司   2013年01月23日 10:30   3482
  使用說(shuō)明:
  
  1.準(zhǔn)備溶液:溫融解試劑盒中的三種試劑,溶解后立即放置在冰上,混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽
  
  提試劑A備用,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細(xì)胞核蛋白抽提試
  
  劑備用,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。
  
  2.對(duì)于貼壁細(xì)胞:用PBS洗一遍,用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞,或用EDTA溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊,
  
  并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞,盡zui大努力吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用*
  
  消化細(xì)胞,以免*降解需抽提的目的蛋白。
  
  3.對(duì)于懸浮細(xì)胞:用PBS洗一遍,離心收集細(xì)胞,盡zui大努力吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。
  
  4.每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。(對(duì)于二百萬(wàn)Hela細(xì)胞,其細(xì)胞
  
  沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)
  
  5.zui高速劇烈Vortex5秒,把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開(kāi)。(如果細(xì)胞沉淀沒(méi)有*懸浮并分散開(kāi),可
  
  以適當(dāng)延長(zhǎng)vortex時(shí)間。)
  
  6.冰浴10-15分鐘。
  
  7.加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B10微升。zui高速劇烈Vortex5秒,冰浴1分鐘。
  
  8.zui高速劇烈Vortex5秒,4℃12,000-16,000g離心5分鐘。
  
  9.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中,即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白。可以立即使用,也可以凍存。(千
  
  萬(wàn)不要觸及沉淀,可以在沉淀上方保留極小體積的上清,以免觸及沉淀。)
  
  10.對(duì)于沉淀,*吸盡殘余的上清,加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會(huì)
  
  帶來(lái)細(xì)胞漿蛋白的污染。)
  
  11.zui高速劇烈Vortex15-30秒,把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開(kāi)。然后放回冰浴中,每隔1-2分鐘再高速
  
  劇烈Vortex15-30秒,共30分鐘。
  
  12.4℃12,000-16,000g離心10分鐘。
  
  13.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中,即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白??梢粤⒓词褂?,也可以-70℃凍
  
  存。
  
  14.對(duì)于新鮮組織:
  
  A.把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B(例
  
  如200微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成
  
  組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液,并在玻璃
  
  勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。
  
  B.勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi),冰浴放置15分鐘。
  
  C.4℃1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中,為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。(吸上
  
  清時(shí)千萬(wàn)不要觸及沉淀。)
  
  D.對(duì)于沉淀,到了這一步已經(jīng)充分勻漿,但很多細(xì)胞還沒(méi)有破碎。接下去按照使用說(shuō)明的步驟4開(kāi)
  
  始操作,即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作,按照步驟4至步驟13抽提得到細(xì)胞漿蛋
  
  白和細(xì)胞核蛋白。抽提得到的細(xì)胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細(xì)胞漿蛋白合并。
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