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放線菌屬于原核生物系統(tǒng)進(jìn)化樹上的(G+C)摩爾百分含量(mol%)高的革蘭氏陽性菌(Eubacteria)分枝類群,它雖然具有原核生物的分子生物學(xué)特性,但在其不同類群中,細(xì)胞壁的化學(xué)組分變化很大。在做大腸桿菌超聲時,采用的是400W,破碎5s停5s的方法,效果不錯,但是用在鏈霉菌上,由于細(xì)胞壁組成差異一般沒什么效果。
鏈霉菌(放線菌)超聲破碎前處理一般是配置成一定濃度的菌懸液。使用超聲破碎時采用的具體條件是:
(1)取細(xì)菌的24 h培養(yǎng)液于5 000 r/min 下離心5 min收集菌體。
(2)用pH 7.5的Na2HPO -NaH2PO 緩沖液洗滌3次,再用該緩沖液將菌體配成1:3的菌懸液。置于40 mL大塑料試管內(nèi)。
(3)將大塑料試管置于冰浴中,采用超聲波破碎(功率200W,1/2”探頭,破碎30s,間歇30s)。
(4)破碎液于12 000 r/min下高速冷凍離心30 min,收集細(xì)胞碎片和上清夜。洗滌菌體也可以用預(yù)冷的生理鹽水或pH8的Tris-HCl,洗滌一次就可以。另外,超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大,功率可以到400-600w,破碎5s,停5s,冰浴,要加終濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強(qiáng)度和次數(shù),有必要隨時鏡檢觀察菌體是否破碎。
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