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ELISA法檢測(cè)肺炎衣原體

    肺炎衣原體感染廣泛存在于*，以隱性感染為主。其臨床表現(xiàn)多樣，主要引起人非典型肺炎，還可引起咽炎、支氣管炎、虹膜炎、肝炎、心內(nèi)膜炎及結(jié)節(jié)性紅斑等，亦是艾滋病、白血病等疾病繼發(fā)感染的重要病原，且與冠心病的發(fā)生相關(guān)，嚴(yán)重威脅人類健康。常見檢查方法為ELISA法檢測(cè)肺炎衣原體抗體。

    [檢測(cè)方法]  ELISA法

    [方法學(xué)原理]  采用ELISA法，血清加到包被純化的肺炎衣原體抗原的微滴孔中，使之發(fā)生反應(yīng)，然后去除未結(jié)合的抗體，加入結(jié)合有HRP的抗人Ig抗體使之與已結(jié)合的抗體反應(yīng)，結(jié)合的HRP與發(fā)色底物發(fā)生顏色反應(yīng)。zui后，終止底物反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀出光密度值。

    [標(biāo)本準(zhǔn)備]  取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內(nèi)不能進(jìn)行試驗(yàn)，分離血清后將其保存于一20℃環(huán)境中。檢測(cè)時(shí)，使樣本恢復(fù)至室溫。

    [試劑]

    1．預(yù)包被微孔板

    2．陽性對(duì)照

    3．弱陽性對(duì)照

    4。陰性對(duì)照

    5．標(biāo)本稀釋液

    6，濃縮酶聯(lián)物

    7，底物A、B

    8．終止液

    [儀器]  酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

    [檢測(cè)步驟]

    1．配制洗滌液  l瓶濃縮洗滌液加475ml蒸餾水。配好的洗滌液短期內(nèi)可置室溫環(huán)境中，長期可存于2—8℃環(huán)境中。

    2．配制酶聯(lián)物  按1：101倍稀釋，即取1u1濃縮酶聯(lián)物加酶聯(lián)物稀釋液1 000ul（根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定稀釋量），未用完的丟棄。

    3．待試劑盒平衡至室溫后，待測(cè)標(biāo)本按1；51稀釋，即取4tA血清與200u1標(biāo)本稀釋液混合。

    4．將稀釋標(biāo)本置37℃環(huán)境中20min。

    5。各加100ul陽性、弱陽性、陰性對(duì)照及已稀釋待測(cè)標(biāo)本上清液于相應(yīng)孔中，空白對(duì)照孔加100u1標(biāo)本稀釋液，蓋好反應(yīng)板，置37℃環(huán)境中30min。

    6。甩盡板中液體，每孔用200～300ul洗滌液洗5次，每次均需拍干。

    7．每孔加酶聯(lián)物100~1，蓋好反應(yīng)板，置37℃環(huán)境中30min。

    8．甩盡板中液體，洗5次，每次拍干。

    9．加底物A、B各1滴或各50tzl，混勻，置37℃環(huán)境中15min。

    10．取出，加終止液1滴，用酶標(biāo)儀450nm測(cè)其OD值。若肉眼觀察則不加終止液，直接判斷結(jié)果。

    [結(jié)果判斷）

    1．陰性對(duì)照平均OD值須小于0．20。

    2．弱陽性對(duì)照平均OD值須在0．20—0．65。

    3．弱陽性對(duì)照與陰性對(duì)照的平均OD值之比須≥2。符合以上3個(gè)條件時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果可信，否則重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

    4．若待測(cè)標(biāo)本孔顯色比弱陽性對(duì)照孔深則判為陽性，反之為陰性。但在弱陽性對(duì)照值上下10％范圍內(nèi)再測(cè)1次，如確實(shí)高于弱陽性對(duì)照則可判為陽性。

    [正常參考值]  肺炎衣原體抗體陰性

    [注意事項(xiàng)]   

    1．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果須結(jié)合臨床表現(xiàn)、病史作出診斷后，方可采取適當(dāng)臨床處理。

    2。試劑盒雖然含有消除干擾因子的物質(zhì)，但仍可能有少量標(biāo)本難以除盡干擾。因此，如某標(biāo)本多項(xiàng)IgM均為陽性，應(yīng)考慮RF的干擾。

    [臨床意義]  肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體主要引起呼吸系統(tǒng)感染。肺炎衣原體抗體的檢測(cè)主要用于肺炎衣原體肺炎的輔助診斷和肺炎衣原體感染的流行病學(xué)調(diào)查。肺炎衣原體抗體在健康成人中的陽性率約25％～50％，而兒童陽性率低于成人。