生物固體微波殺菌及機(jī)理研究

微波加熱原理
　　波是頻率從300MHz～300GMHz的電磁波，其方向和大小隨時(shí)間作周期性變化。微波與物料直接作用，將超高頻電磁波轉(zhuǎn)化為熱能的過(guò)程即為微波加熱過(guò)程。水是強(qiáng)烈吸收微波的物質(zhì)，物料中的水分子是極性分子，在微波作用下，其極性取向隨著外電磁場(chǎng)的變化而變化，915MHz的微波 可使水分子每秒運(yùn)動(dòng)18.3億次，致使分子急劇磨擦、碰撞，使物料產(chǎn)生熱化和膨化等一系列過(guò)程而達(dá)到微波加熱目的 

微波殺菌機(jī)理

微波殺菌是微波的熱效應(yīng)和生物效應(yīng)共同作用的結(jié)果。微波對(duì)細(xì)菌的熱效應(yīng)是使蛋白質(zhì)變性，使細(xì)菌失去營(yíng)養(yǎng)、繁殖和生存的條件而死亡；生物效應(yīng)是微波電場(chǎng)改變細(xì)胞膜斷面的電位分布，影響細(xì)胞周?chē)娮雍碗x子濃度，從而改變細(xì)胞膜的通透性能，細(xì)菌因此營(yíng)養(yǎng)不良，不能正常新陳代謝，細(xì)菌結(jié)構(gòu)功能紊亂，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑 制而死亡。此外，決定細(xì)菌正常生長(zhǎng)和穩(wěn)定遺傳繁殖的核酸（RNA）和脫氧核糖酸（DNA），是由若干氫鍵緊密連接而成的卷曲形大分子。足夠強(qiáng)的微波場(chǎng)可以導(dǎo)致氫鍵松馳、斷裂和重組，從而誘發(fā)遺傳基因突變，或染色體畸變，甚至斷裂。 微波加熱主要特點(diǎn)：1、加熱迅速、
　　微波加熱與傳統(tǒng)的加熱方式不同，不需熱傳導(dǎo)過(guò)程，它是使被加熱物料本身成為加熱體，因此即使是熱傳導(dǎo)性較差的物料，也可以在極短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到加熱溫度。
2、均勻

無(wú)論物體各部位形狀如何，它是使物料表里表里同時(shí)均勻滲透電磁波而產(chǎn)生熱能，不受物體形狀限制，所以加熱更均勻，不會(huì)出現(xiàn)外焦內(nèi)生的現(xiàn)象

3、節(jié)能高效
　　由于含有水份的物質(zhì)極易吸收微波而發(fā)熱，因此，除少量的傳輸損耗外幾乎無(wú)其它損耗。微波加熱與遠(yuǎn)紅外加熱相比，節(jié)約能源1/3以上。
4、防霉殺菌，不破壞物料營(yíng)養(yǎng)成分
　　微波加熱具有熱力效應(yīng)和生物效應(yīng)，因此，能在較低溫度下殺死霉菌和細(xì)菌；傳統(tǒng)加熱方式加熱時(shí)間較長(zhǎng)，造成營(yíng)養(yǎng)成分損失較大，而微波加熱迅速，能zui大限度地保存物料的活性和食品中的營(yíng)養(yǎng)成份。

5、工藝*，可連續(xù)生產(chǎn)
　　只要控制微波功率即可實(shí)現(xiàn)加熱或終止。應(yīng)用PLC人機(jī)界面可進(jìn)行加熱工藝過(guò)程規(guī)范的可編程自動(dòng)化控制，它有完善的傳送系統(tǒng)，可確保連續(xù)化生產(chǎn)，節(jié)省勞力。

6、安全無(wú)害
　　微波是控制在金屬制成的加熱室內(nèi)工作，微波泄漏被有效抑制，不存在放射線(xiàn)危害及有害氣體的排放，不產(chǎn)生余熱和粉塵污染，極不污染實(shí)物也*。

城市生活污水中病原物種類(lèi)繁多，zui常見(jiàn)的為腸道細(xì)菌、蠕蟲(chóng)寄生蟲(chóng)及病毒，其它（如真菌類(lèi)、變形蟲(chóng)屬等）則極少。這些病原物在污水處理過(guò)程中，大部分被保留或結(jié)合在生物固體顆粒物上，從而得到濃縮，其數(shù)量比污水中的數(shù)量要高得多。      生物固體作為農(nóng)肥或土壤改良劑是目前主要的生物固體有效利用處置方法。要防止生物固體施用過(guò)程中對(duì)環(huán)境造成病原物污染，zui有效的措施就是減少生物固體中病原物的數(shù)量。我國(guó)農(nóng)田灌溉水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB5084-92）規(guī)定：糞大腸桿菌菌群數(shù)應(yīng)小于10000個(gè)/L，蛔蟲(chóng)卵數(shù)應(yīng)不超過(guò)2個(gè)/L，該標(biāo)準(zhǔn)指出灌溉水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)也適用于農(nóng)用的生物固體，因此生物固體的殺菌處理應(yīng)達(dá)到此項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。      目前常用的生物固體殺菌處理方法有厭氧消化、自然干燥堆肥和熱處理。厭氧消化殺菌效果不能達(dá)到農(nóng)用標(biāo)準(zhǔn)，自然干燥堆肥殺菌時(shí)間長(zhǎng)，熱處理的效率一般。微波殺菌是制造一個(gè)物理環(huán)境使微生物死亡，這個(gè)環(huán)境包括熱力的溫度場(chǎng)和頻率*的交變電磁場(chǎng)。兩種物理場(chǎng)共同作用于生物固體中的微生物，從而達(dá)到殺菌的效果，克服了上述幾種方法的不足。同時(shí)，微波對(duì)腸道細(xì)菌、蠕蟲(chóng)寄生蟲(chóng)和部分病毒都有殺菌作用，具有良好的應(yīng)用前景。      大腸桿菌在自然界分布很廣，是人和動(dòng)物腸道中的正常菌群，正常情況下一般不會(huì)致病，但它是條件致病菌。本實(shí)驗(yàn)以糞大腸桿菌作為指示菌，比較了微波殺菌和傳統(tǒng)加熱殺菌后生物固體中糞大腸桿菌菌群數(shù)的變化，通過(guò)酶活性檢測(cè)和透射電鏡觀察，進(jìn)一步探討了微波殺菌的機(jī)理。1試驗(yàn)過(guò)程與方法1.1試驗(yàn)條件   試驗(yàn)設(shè)備為經(jīng)過(guò)改裝的微波爐，其腔體截面積為29cm×26cm，試驗(yàn)時(shí)，微波頻率為2450MHz。1.2加熱殺菌后糞大腸桿菌菌群數(shù)變化的檢測(cè)    取500g含水率為60%的生物固體，攤鋪于表面皿中，物料厚度1cm，置于恒溫烘箱中，記錄生物固體的溫度剛好達(dá)到烘箱設(shè)定溫度所需的時(shí)間。選擇3種不同的溫度（分別對(duì)應(yīng)于3種不同功率處理5min的溫度），從生物固體達(dá)到烘箱設(shè)定溫度時(shí)開(kāi)始記時(shí)，選擇4種加熱時(shí)間（5min、10min、20min、30min）進(jìn)行殺菌處理，測(cè)定糞大腸桿菌菌群數(shù)。1.3微波殺菌后糞大腸桿菌變化的檢測(cè)    取500g初始含水率為60%的生物固體，攤鋪在微波爐托盤(pán)上，物料厚度1cm，選擇3種微波輸出功率（100W、300W、600W），5種不同的輻照時(shí)間（1min、2min、3min、4min、5min）在SL-800微波爐中進(jìn)行處理，處理結(jié)束時(shí)迅速打開(kāi)爐門(mén)測(cè)量載體的溫度，并測(cè)定處理前后試樣的糞大腸桿菌菌群數(shù)。1.4糞大腸桿菌菌群數(shù)檢測(cè)方法    由含有N、P、S、K、Na等元素的無(wú)機(jī)鹽、微量乳糖、微量蛋白胨、損傷型大腸桿菌復(fù)蘇劑、雜菌抑制劑、酶底物及微量元素混合液等按比例配成培養(yǎng)基。采用兩種不同的特定酶底物：鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）和4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸（MUG），分別與占糞大腸桿菌90%的埃希氏大腸桿菌產(chǎn)生的葡萄糖苷酸酶起反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可辨的黃色產(chǎn)物鄰硝基酚和在360nm紫外線(xiàn)照射下閃現(xiàn)藍(lán)色熒光的4-甲基傘形酮水解產(chǎn)物。通過(guò)觀察經(jīng)24h 37℃培養(yǎng)后的水樣的顏色變化及紫外線(xiàn)照射下的熒光現(xiàn)象，判斷所檢測(cè)水樣中糞大腸桿菌菌群數(shù)的含量水平。    采用“4排20孔法”，以無(wú)本底藍(lán)色熒光的玻璃試管為容器，每份水樣平行做兩份各20管，即在4排試管中分別加入原水樣、10倍、100倍稀釋水樣和空白樣對(duì)照液，取液量均為1ml，同時(shí)各加入培養(yǎng)基1ml及相應(yīng)量的酶底物，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24h后，觀察并記錄每份水樣中糞大腸桿菌菌群數(shù)（MPN值）。1.5透射電鏡觀察   取未處理生物固體試樣、微波殺菌處理6min和12min的生物固體試樣各1g，加10ml無(wú)菌蒸餾水，混勻5min，倒出上清液，以400r/min離心分離10min，取分離后的沉淀制成標(biāo)本，以透射電鏡生物樣本制備法［4］對(duì)標(biāo)本進(jìn)行固定，用丙酮逐級(jí)脫水后，再以環(huán)氧樹(shù)脂包埋，做成超薄切片。用醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染，在透射電鏡下觀察。1.6酶活性檢測(cè)    取未處理生物固體試樣、微波殺菌處理6min和12min的生物固體試樣各1g，加10ml無(wú)菌蒸餾水洗滌，洗滌液靜置5min，倒出上清液，用0.03mol/L磷酸鹽緩沖液（Ph=7.4）稀釋?zhuān)诓Ｆ贤科?。?jīng)Pearse標(biāo)準(zhǔn)法［5］處理后，在顯微鏡下觀察乳酸脫氫酶（LHD）、輔酶Ⅱ（NADH）與細(xì)胞色素氧化酶（CCO）的變化。2結(jié)果與討論2.1微波殺菌和加熱殺菌效果的比較    將試驗(yàn)得到的糞大腸桿菌菌群數(shù)轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值lgR，以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，lgR為縱坐標(biāo)作圖（圖1、圖2）。由圖1和圖2可知，100W微波功率條件下處理5min時(shí)，生物固體試樣的溫度剛剛達(dá)到35℃，此時(shí)殘留菌群數(shù)的lgR值為4.27，而生物固體在35℃干熱條件下，持續(xù)處理5min時(shí)殘留菌群數(shù)的lgR值為4.53。600W微波功率條件下處理5min時(shí)，生物固體的溫度剛剛達(dá)到90℃，殘留菌群數(shù)的lgR值為0.65，而生物固體在90℃干熱條件下，持續(xù)處理10min時(shí)殘留菌群數(shù)的lgR值為4.38，兩者的糞大腸桿菌菌群數(shù)相差4個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，在300W以上功率的微波輻照下，生物固體輻照4min后，糞大腸桿菌菌群的lgR值已小于3，達(dá)到農(nóng)用控制標(biāo)準(zhǔn)4的要求。而在90℃下，生物固體加熱25min，lgR值仍未達(dá)到農(nóng)用控制標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明微波殺菌的效果要遠(yuǎn)好于傳統(tǒng)的加熱殺菌?！?nbsp;  2.2微波殺菌的非熱效應(yīng)機(jī)制    電磁場(chǎng)作用于生物體，能引起兩類(lèi)生物效應(yīng)：一類(lèi)是熱效應(yīng)，指溫度升高并由此而引起生理和病理變化的作用，這是生物體內(nèi)各層次的生物物質(zhì)吸收電磁波后轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮苤?；還有一類(lèi)為非熱效應(yīng)，指電磁場(chǎng)通過(guò)使生物體溫度升高的熱作用以新的方式改變生理生化過(guò)程的效應(yīng)。微波作用能改變生物性排列聚合狀態(tài)及其運(yùn)動(dòng)規(guī)律，而且微波場(chǎng)感應(yīng)的離子流，會(huì)影響細(xì)胞膜附近的電荷分布，導(dǎo)致膜的屏障作用受到損傷，產(chǎn)生膜功能障礙，從而干擾或破壞細(xì)胞的正常新陳代謝功能，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)抑制、停止或死亡。再則細(xì)胞中的核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）在微波場(chǎng)力作用下可導(dǎo)致氫鍵的松弛、斷裂或重組。誘發(fā)基因突變或染色體畸變，從而影響其生物活性的改變，延緩或中斷細(xì)胞的穩(wěn)定遺傳和增殖。    從分子運(yùn)動(dòng)觀點(diǎn)考慮，溫度實(shí)質(zhì)是指分子熱運(yùn)動(dòng)的劇烈程度，溫度越高，分子熱運(yùn)動(dòng)程度越劇烈，表明熱力強(qiáng)度越大。傳統(tǒng)加熱殺菌實(shí)際上是熱力強(qiáng)度造成細(xì)菌致死，而不是熱量致死，它不能單純從能量的數(shù)量轉(zhuǎn)換來(lái)解釋。同樣，微波殺菌的作用，除了有熱力強(qiáng)度致死因素，還有電磁輻照改變細(xì)菌生態(tài)活動(dòng)致死的因素。細(xì)菌被微波輻照時(shí)所處的物理環(huán)境既包括溫度場(chǎng)，也包括電磁場(chǎng)。在電磁場(chǎng)中細(xì)菌能出現(xiàn)電性質(zhì)的強(qiáng)烈反應(yīng)，例如，細(xì)胞內(nèi)水分子作為電極性分子，在交變電磁場(chǎng)中出現(xiàn)隨磁場(chǎng)頻率變化的電極性振蕩，電容性的細(xì)胞膜將被擊穿而破裂。    用回歸法計(jì)算微波殺菌和加熱殺菌D值（圖1和圖2直線(xiàn)斜率的負(fù)倒數(shù)）。   由表1和表2可知，D值越小，殺菌速率越快，效果越好。100W微波功率下的D值（35.6）比60℃干熱條件下的D值（48.3）小，到300W和600W微波功率下D值更小，相差得更大?！?    由此可見(jiàn)，微波殺菌除了溫度場(chǎng)的作用外，由于電磁場(chǎng)的存在，生物固體達(dá)到同樣溫度條件時(shí)，微波殺菌的效果明顯好于加熱殺菌，微波的滅菌速率也明顯比加熱殺菌快得多。說(shuō)明微波殺菌過(guò)程中存在電磁場(chǎng)的非熱效應(yīng)。2.3透射電鏡觀察結(jié)果    在透射電鏡下觀察，正常大腸桿菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜完整、光滑，細(xì)胞壁緊貼細(xì)胞膜，細(xì)胞漿內(nèi)容均勻，見(jiàn)圖3（a）。經(jīng)微波殺菌處理6min后菌體變形，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間空隙增寬，細(xì)胞壁表面出現(xiàn)皺褶并部分模糊不清，細(xì)胞漿內(nèi)容物不均勻，見(jiàn)圖3（b）。微波處理10 min后，生物固體的含水率降低到40%以下，這樣的變化更加明顯，見(jiàn)圖3（c）。 2.4酶活性檢測(cè)    顯微鏡下觀察LHD、NADH、CCO3種酶的結(jié)果為：LHD與NADH均為蘭色，CCO為棕褐色。   經(jīng)微波殺菌處理6min后（含水率53.5%）的染色涂片，3種酶的染色均較淺；微波處理12min后（含水率30.2%），樣品染色涂片幾乎無(wú)色。這表明，3種酶的活性近乎喪失。由此可以推斷：微波通過(guò)抑制或破壞細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶、輔酶Ⅱ與細(xì)胞色素氧化酶等與生物氧化、呼吸代謝及能量產(chǎn)生有關(guān)的酶的活性，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。3結(jié)論   1） 初始含水率為60%的生物固體，經(jīng)微波輻照處理后，衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)指標(biāo)（糞大腸桿菌菌群數(shù)的MPN值）可以達(dá)到農(nóng)用控制標(biāo)準(zhǔn)的要求。     2） 微波處理過(guò)程中，生物固體剛剛達(dá)到干熱殺菌控制的溫度時(shí)，其殺菌效果就已經(jīng)明顯比干熱殺菌效果好，證明微波殺菌過(guò)程中存在非熱效應(yīng)機(jī)制。     3） 微波是通過(guò)抑制或破壞微生物細(xì)胞內(nèi)與生物氧化、呼吸代謝及能量產(chǎn)生有關(guān)的酶的活性來(lái)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的。