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糖化酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)

、能力目標(biāo)

①借助相關(guān)材料，能完成糖化酶制劑的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程的操作。

②理解酶制劑超濾濃縮的原理，并能立完成其操作步驟。

③理解無(wú)機(jī)鹽沉淀和有機(jī)溶劑沉淀法提取酶的原理，能立操作其過(guò)程。

二、生產(chǎn)工藝流程

糖化酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程如圖6-16所示。

斜面培養(yǎng)—獲皮種子——上濾熔養(yǎng)——板抵過(guò)法—超濾依——沉淀——泥干燥圖6-16糖化酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程

三、實(shí)訓(xùn)材料

1.菌種

黑曲霉UV-11.

2.培養(yǎng)麩

（1）斜面培養(yǎng)基

土豆培養(yǎng)基。

（2）獲皮種子培養(yǎng)基

小麥麩皮與水的比例為1：（1.1~1.3），接種后于30~32℃培養(yǎng)4~5d至長(zhǎng)滿豐富的孢子，中間翻曲。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉13.5%，豆餅粉3.5%，麩皮1.0%，玉米漿2.0%，無(wú)機(jī)鹽。

3.實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

滅菌鍋、試管、棉塞、培養(yǎng)基原料、培養(yǎng)箱、500mL三角瓶。

251.全自動(dòng)發(fā)酵熊、恒溫培養(yǎng)箱、板框壓濾機(jī)、膜過(guò)濾裝置。

四、操作要點(diǎn)

1.種子剖備

固體孢子培養(yǎng)：將10g麩皮和10ml.水拌勻后滅菌30min，冷卻后接入環(huán)斜面菌種，于30~32℃培養(yǎng)4~5d至長(zhǎng)滿豐富的孢子備用，種子罐培養(yǎng)：玉米粉6%，黃豆餅粉2%，麩皮2%。在31℃下通風(fēng)培養(yǎng)32h，通氣比為0.5：1，當(dāng)pH下降到3.8，酶活力在500U/mL左右，鏡檢菌絲生長(zhǎng)正常且無(wú)雜菌污染時(shí)，即可接入二種子罐或發(fā)酵罐。

2.251.維發(fā)酵

按配方配制培養(yǎng)基（裝液量15l），調(diào)pH至4.0，加入發(fā)酵罐中，121℃滅落30min，冷卻，待溫度降至30~32℃，接人個(gè)三角瓶的孢子懸液或種子罐培養(yǎng)的種子，在30℃、罐壓0.05MPa下攪拌培養(yǎng)，攪拌速度為500r/min。通氣比：0~12h為0.5：1；12~24

h為0.8：1；24~84h為1.0：1；84h后為0.8：1。

3.發(fā)酵過(guò)程監(jiān)控

每隔12h取樣測(cè)定酶活力、pH、還原糖及總糖濃度并作鏡檢。當(dāng)pH降至3.4，還原糖降至1.8%以下，醇活力上升至13600I/ml.以上時(shí)，即可放錯(cuò)。

4.發(fā)酵液過(guò)泌

洗凈板框壓濾機(jī)，裝好濾布，接好板框壓濾機(jī)的管道，泵料過(guò)濾，加水洗滌，空氣吹干，過(guò)濾結(jié)束后洗凈過(guò)濾機(jī)及有關(guān)設(shè)備。取濾液體積，取樣測(cè)定糖化酶活力。

5.超濾濃館

取10L糖化酶的濾液加人到超濾裝置的儲(chǔ)罐中，開(kāi)動(dòng)循環(huán)料液泵進(jìn)行超濾，控制超濾壓力小于0.4MPa。每隔20min用量筒測(cè)量透過(guò)液流量，比較透過(guò)液流量的變化。

當(dāng)濃縮倍數(shù)達(dá)到3~5倍時(shí)，停止超濾。

測(cè)濃縮液體積，原酶液、濃縮液和透過(guò)液的酶活力。

6.有機(jī)溶刻沉淀

取1L濃縮液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.5.在10~~20℃條件下加入3.5倍冷凍的*，邊加邊攪拌，即可發(fā)現(xiàn)酶的沉淀現(xiàn)象。沉淀物用布氏漏斗抽濾。稱(chēng)量酶泥的質(zhì)量，測(cè)定酶活力，

7.無(wú)機(jī)鹽沉淀

取1l.濃縮液，按55g/（100ml.）加硫酸銨，靜止鹽析1h。沉淀物用布氏漏斗抽濾。

稱(chēng)酶泥的質(zhì)量，測(cè)定酶活力。

8.酶泥的干燥

將上述步驟中得到的酶泥放入干燥箱中，在40℃下以熱風(fēng)干燥，將干燥的制品磨粉即得成品。將成品稱(chēng)量并測(cè)定酶活力。

五、過(guò)程檢驗(yàn)及成品酶活力測(cè)定

1.黑曲霉鍵檢

（1）染料

草酸銨結(jié)品紫液（A液：1%結(jié)晶紫加95%酒精溶液；B液：1%草酸銨溶液，取A液20mL，B液80mL混合，靜置48h后使用）。

（2）鏡檢過(guò)程

涂片→干燥→固定→染色水洗干燥→鏡檢。

2.總糖的測(cè)定

要林法測(cè)定發(fā)酵液中的總糖。

3.還原糖的測(cè)定

DNS法，參考本書(shū)相關(guān)內(nèi)容：

4.樹(shù)化酶酶活力的測(cè)定

參考本書(shū)相關(guān)內(nèi)容。

5.pH、溶解氧的跟蹤測(cè)定

從二次儀表直接讀取。

六、實(shí)訓(xùn)報(bào)告

寫(xiě)出書(shū)面實(shí)訓(xùn)報(bào)告，并著重分析過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題以及解決的辦法。

七、實(shí)訓(xùn)思考題

1.還原糖的測(cè)定除了DNS法還有什么方法？

2.糖化酶固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵的異同有哪些？

模塊七

新型發(fā)酵技術(shù)

項(xiàng)目1固定化細(xì)胞生產(chǎn)技術(shù)