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菌種的原生質(zhì)體融合育種方法

要使發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的種類、產(chǎn)量和質(zhì)量有較大的改善，先必須選取性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。菌種選育包括根據(jù)菌種的自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及根據(jù)遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和方法利用誘變育種技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程技術(shù)而進(jìn)行的誘變育種、細(xì)胞工程育種、基因工程育種等。

原生質(zhì)體融合育種

細(xì)胞壁被酶解剝離，剩下的由原生質(zhì)膜包圍的原生質(zhì)部分稱為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體融合是通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生全重組子的過程。原生質(zhì)體融合技術(shù)是繼轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等微生物基因重組方式之后，又個其重要的基因重組技術(shù)。原生質(zhì)體融合技術(shù)的運用，使細(xì)胞間基因重組的頻率大大提高，基因重組親本的選擇范圍也得以擴(kuò)大，可以在不同種、屬、科，甚至更遠(yuǎn)緣的微生物之間進(jìn)行。這為利用基因重組技術(shù)培育更多更優(yōu)良的生產(chǎn)菌種提供了可能。原生質(zhì)體融合技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌的育種。

微生物原生質(zhì)體融合分為以下五大步驟：

1.選擇親株

為了能明確檢測到融合后產(chǎn)生的重組子并計算重組頻率，參與融合的親株般都需要帶有可以識別的遺傳標(biāo)記。常用營養(yǎng)缺陷型或抗藥性作為標(biāo)記，也可以采用熱致死、孢子顏色、菌落形態(tài)等作為標(biāo)記。在進(jìn)行原生質(zhì)體融合前，應(yīng)先測定菌株各遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性，如果自發(fā)回復(fù)突變的頻率過高，則不宜采用。

2.原生質(zhì)體制備

為了制備原生質(zhì)體，去除細(xì)胞壁是關(guān)鍵。去壁的方法有三種：機(jī)械法、非酶分離法和酶解法。般都采用酶解法去壁，根據(jù)微生物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的不同，需分別采用不同的酶，如、纖維素酶、蝸牛酶等。

放線菌肽聚糖革蘭氏陰性菌肽聚糖和脂多糖和EDTA霉菌纖維素和幾丁質(zhì)纖維素酶或真菌中分離的溶壁酶酵母菌葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶

在菌體生長的培養(yǎng)基中添加，可以使菌體較容易被酶解，滲入細(xì)胞壁肽聚糖中代替D的位置，影響細(xì)胞壁中各組分間的交聯(lián)度。在菌體生長階段添加蔗糖，擾亂菌體的代謝，也能提高細(xì)胞壁對的敏感性。因為能干擾肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)肽作用，使多糖部分不能交聯(lián)，從而影響肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，所以，在菌體生長對數(shù)期加入適量，能使細(xì)胞對更敏感。

3.原生質(zhì)體融合

聚乙二醇（pEG）能有效地促進(jìn)原生質(zhì)體融合。其助融作用可能與下列過程有關(guān)：開始時，由于強烈的脫水而使原生質(zhì)體粘在起，并形成聚合體。原生質(zhì)體收縮并高度變形，使原生質(zhì)體之間的接觸面增大。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，加大了細(xì)胞膜的流動性，膜內(nèi)的蛋白質(zhì)和糖蛋白相互作用和混合，使緊密接觸的原生質(zhì)體相互融合。pEG對細(xì)胞尤其是原生質(zhì)體也有定的毒害作用，因此，作用的時間般不宜過長。pEG有不同的聚合度。在細(xì)菌原生質(zhì)體融合中，多采用高相對分子質(zhì)量的pEG（如pEG6000）；對放線菌則可采用各種相對分子質(zhì)量的pEG。pEG的使用濃度范圍般在30%~50%，但隨著微生物種類的不同而異。此外，物理融合劑，如電場和激光也能有效促進(jìn)融合。

4.融合體再生

融合體再生就是使原生質(zhì)體融合體重新長出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。能再生細(xì)胞壁的原生質(zhì)體只占總量的部分。細(xì)菌般再生率為3%~10%；真菌再生率般在20%~80%；鏈霉菌再生率高可達(dá)50%。若要獲得較高的再生率，在實驗過程中應(yīng)避免因強力動作而使原生質(zhì)體破裂。在將原生質(zhì)體懸液涂布在再生培養(yǎng)基平板上前，宜預(yù)先去除培養(yǎng)基表面的冷凝水。涂布時，原生質(zhì)體懸液的濃度不宜過高。因為若有殘存的菌體存在，它們將會在再生培養(yǎng)基中長成菌落，并抑制周圍原生質(zhì)體的再生。另外，菌齡、再生時的溫度、用量和溶壁時間等因素都會影響原生質(zhì)體融合體的再生。

5.篩選優(yōu)良性狀融合重組子

重組子的檢出方法有三種：直接法、間接法和鈍化選擇法。直接法是將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。間接法是把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上，檢出重組子。鈍化選擇法是在融合前使親本中的方（野生型）原生質(zhì)體代謝途徑中的某些酶鈍化不能再生，再與另方（雙缺陷型）原生質(zhì)體融合，融合體在基本培養(yǎng)基上分離。

以上獲得的還僅僅是融合重組子，尚需進(jìn)行生理生化測定及生產(chǎn)性能的測定，以確定是否符合育種的要求。