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活細(xì)胞成像設(shè)備的選擇-北京中顯
閱讀：1272 發(fā)布時間：2013-4-8為活細(xì)胞研究設(shè)計光學(xué)顯微系統(tǒng)時，首要考慮的是檢測器的敏感度（對信號乃至噪音的檢測），圖像獲取的速度，以及在此基礎(chǔ)上標(biāo)本的可行性。對于固定細(xì)胞的成像，曝光時間及光強度相對來說都很高，這時可能會造成光漂白；然而對于活細(xì)胞成像，上述光的影響必須去除。幾乎在所有情況下，活細(xì)胞顯微鏡都會在盡可能高的圖像質(zhì)量與盡可能好的細(xì)胞活性之間取得一個平衡。對于此類實驗，時間及空間上的分辨率需要設(shè)定在能滿足實驗要求的水平上，而不是給予過度的光照或設(shè)定過多采樣時間點。
基本上,一個理想的活細(xì)胞成像系統(tǒng)必需有足夠的敏感度，來滿足在弱熒光條件下仍能得到高圖片質(zhì)量；同時，系統(tǒng)也必需足夠快，以記錄整個動態(tài)過程。 另外，這個系統(tǒng)還需要有足夠高的分辨率以捕捉樣品細(xì)節(jié)，并且能夠準(zhǔn)確的實時測量每個微小的光強變化。然而不幸的是，要改善上述的任意一條都需建立在犧牲其它性能的基礎(chǔ)上。因此現(xiàn)在還不能夠設(shè)計出一個可以滿足所有要求的活細(xì)胞成像體系。研究人員現(xiàn)在只能在盡量減低不重要的信息的遺失的同時，盡可能的獲得zui優(yōu)的重要參數(shù)。這樣，顯微鏡的配置zui終取決于成像的要求，對于樣品在實驗期間活性的要求，進(jìn)行標(biāo)記的難度水平，以及儀器的可用性等實際因素。
如圖一（Figure 1）所示為一臺倒置研究級顯微鏡，它配有四個相機接口，并可滿足對培養(yǎng)的組織的研究。在四個接口上分別配有四個不同的相機，每一個都用來獲取不同的圖像。在大多數(shù)情況下，這種顯微鏡的分光設(shè)計是100％進(jìn)入相機或以80：20的比例同時分配給相機和目鏡。在弱光成像時，研究人員必需確保將zui敏感的相機接在100％分光口上。在圖一中，彩色CCD（Full color CCD）接在顯微鏡的底部（a），它從物鏡接受的光信號不經(jīng)過棱鏡或反光鏡的反射。這樣的相機通常用來進(jìn)行多色熒光或明場拍攝。顯微鏡右側(cè)連接的電子倍增電荷偶聯(lián)設(shè)備（Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD）（b），它通常用來檢測極弱的熒光信號。接在顯微鏡左側(cè)的相機（c）配有一個高量子效應(yīng)的感應(yīng)器，可以感應(yīng)700－1000nm 波長范圍內(nèi)的光，所以這個相機可以用來進(jìn)行微分干涉相稱（differential interference contrast，DIC）觀察方法下厚標(biāo)本的紅外線照明成像。zui后，對于高分辨率的單色熒光成像，如全內(nèi)反射熒光或其它熒光技術(shù)，圖一中的顯微鏡在前部（d）配備了Peltier-cool 相機。這個相機zui小像素點為6μm，適合于此類成像的需求。如圖一中的配置非常昂貴，但是它能滿足用戶所有的成像要求。
進(jìn)行活細(xì)胞成像的光學(xué)顯微鏡需要寬光譜增稱模塊。大多數(shù)的研究者使用熒光顯微鏡，通常還會配合一種或多種透射光技術(shù)。其中熒光技術(shù)包括了傳統(tǒng)的寬視場落射熒光，激光掃描共聚焦，真空碟片共聚焦，場掃描共聚焦，多光子，全內(nèi)反射（TIRF），熒光關(guān)聯(lián)光譜，熒光壽命成像（FILM），光活化，鐳射陷阱等技術(shù)。相應(yīng)的成像技術(shù)有光譜成像，多色成像，共定位，時間序列，熒光光漂白恢復(fù)，（FRAP，FLIP，FLAP），熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），熒光散斑顯微鏡，膜片鉗技術(shù)等，以上這些技術(shù)通常要配合一種或多種基礎(chǔ)成像技術(shù)。當(dāng)熒光與明場,DIC,霍夫曼調(diào)制相稱（HMC）,相差等技術(shù)相結(jié)合時,熒光技術(shù)作為探針,可用于定位.對于絕大多數(shù)的活細(xì)胞成像來說,顯微鏡的配置都需要滿足一些特定的需要以保證試驗能夠成功進(jìn)行。除了顯微鏡與數(shù)字成像系統(tǒng)，活細(xì)胞成像還需要考慮到兩個限制因素——一個是保持細(xì)胞的活性，另一個是在北京噪音及自發(fā)熒光的基礎(chǔ)上盡可能的提高信號強度。
提高活細(xì)胞成像的信噪比
活細(xì)胞成像與固定細(xì)胞成像之間的基本區(qū)別是，后者的成像沒有過多的限制， 如合適視野的選定，曝光時間的設(shè)定，電子益增的設(shè)定，讀出率及,偏移值等。這樣，染色的固定樣品的成像就可以充分利用相機的全部動態(tài)設(shè)定。因此，固定成像可以得到理想的信噪比。但不幸的是，由于細(xì)胞活性對照明的嚴(yán)格要求，活細(xì)胞成像的情況又與固定細(xì)胞的成像有所不同。在活細(xì)胞成像時，樣品的灰度往往比背景高不了多少。在這種情況下，成像首要考慮的是檢測系統(tǒng)的暗電流及噪音值。經(jīng)濟型的相機通常噪音都會比較高，導(dǎo)致背景混亂并掩蓋樣品信號，在讀出速率增加時這種影響更為嚴(yán)重。所以，幾乎所有的活細(xì)胞成像設(shè)備質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)都是檢測器的好壞。
數(shù)字圖像的噪音主要由四方面造成，檢測器，照明系統(tǒng)，Poisson 噪音或shot 噪音（由于光子通量的隨機性造成），以及彌散光。在大多數(shù)情況下，通過選擇好的檢測器或優(yōu)化照明條件可以降低系統(tǒng)噪音。事實上，任何一種光子檢測器在記錄的時候都會產(chǎn)生某種形式上的噪音。掃描光聚焦及多光子顯微鏡中的光電倍增管（PMT）會產(chǎn)生雜電子。同樣的，用于明場，全內(nèi)反射，針孔碟片共聚焦，場掃描顯微鏡的CCD也會生成背景暗電流。對此，CCD 及光電倍增設(shè)備也做了一系列的改進(jìn)，比如制冷設(shè)備，它會使儀器工作時保持在低溫狀態(tài)，從而降低暗電流的水平。然而，在讀取光信號并將模擬信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號的時候，特別是CCD這種儀器，也會產(chǎn)生噪音，即read noise，制冷數(shù)碼相機產(chǎn)生的主要噪音。
Figure 2所示為影響活細(xì)胞成像質(zhì)量的數(shù)字相機的讀出速度與敏感度的相互依存關(guān)系。The specimen is a culture of human 圖中樣品為人的宮頸癌細(xì)胞（HeLa 細(xì)胞系），展示mKO（monomeric Kusabira Orange）熒光蛋白與人的α珠蛋白融合，圖片在寬視場熒光下單色相機拍攝，照明中添加TRITC濾片，讀出速度為10或1.25 MHz。Figures 2（a） & 2（b）所示，在關(guān)閉CCD 光閘的條件下，低讀出速度下的噪音要明顯高于高讀出速度下的噪音。但是，如果將CCD 調(diào)節(jié)到全動態(tài)范圍的話，這方面的 影響就不明顯了，如Figures 2（c） & 2（d） 所示；然而，在低光照條件下，低讀出速度（Figure 2（f））的圖片質(zhì)量要明顯的優(yōu)于高讀出速度（Figure 2（e）。 Figures 2（e） & 2（f） 的照明強度大約是 Figures 2（c） & 2（d） 的十分之一。如將照明強度再降低5倍效果會更加明顯，如Figures 2（g） & 2（h），低讀出速度下的圖片至少還能夠表達(dá)出需要的效果（Figure 2（h）），然而高讀出速度下的成像質(zhì)量則很不理想（Figure 2（g））。
一個成功的數(shù)字成像實驗，要求樣品的空間照明模式是連續(xù)的，即整個視野內(nèi)的照明是連續(xù)一致的，每次成像間的圖片也是連續(xù)一致的。這取決于照明光源，使用鎢鹵素?zé)粽彰鳎?/span>樣品的光學(xué)性質(zhì)在顯微鏡下通常都是連續(xù)的（被稱為光學(xué)一致性）。然而使用激光掃描顯微鏡的照明裝置對某一特定的點進(jìn)行掃描，則每一次的掃描結(jié)果都不一樣。另外，使用汞燈（the mercury plasma arc-discharge lamp）作為寬視野熒光顯微鏡的照明光源，圖片結(jié)果會在光譜上體現(xiàn)為特定的分離的波長峰值。相比之下氙燈（Xenon lamps）在可見光譜下的結(jié)果就相當(dāng)連續(xù)，÷但是在它在紫外區(qū)的結(jié)果不佳（這一光譜范圍通常不用于活細(xì)胞成像）。
對于金屬鹵素?zé)?/span>這樣的照明光源，它的特性介于汞燈與氙燈之間，也許是性能*的光源。金屬鹵素?zé)裟?/span>夠提供從紫外到紅外間連續(xù)的光譜，此外，保有汞燈的光強。除了調(diào)整照明光源，為了達(dá)到照明一致的效果，還可以在燈箱及顯微鏡的照明輸入端口之間添加一個光導(dǎo)纖維（或液體光導(dǎo)）。在視場中的照明梯度可以通過計算來矯正（flat-field algorithms）。燈泡有時在輸出的亮度會與平均值有10％的偏離，這時需要注意的是它不能夠通過光學(xué)纖維來矯正，而要使用穩(wěn)定的電源。
對光子通量的測量是統(tǒng)計學(xué)的處理，在檢測信號時會產(chǎn)生偏差。所謂的Poisson 或 shot noise（如前所述），它體現(xiàn)在測量N個光子時，出現(xiàn)的偏差與N的平方根成正比，即信噪比。所以，增加信號光子的數(shù)量N可直接提高信噪比及圖像對比度。提高信號zui簡單的方法是手機更多的光子，通常做法是增加曝光時間或提高激發(fā)照明的強度，但是這些做法會增加光毒性并降低細(xì)胞活性。其次，另一個更有用的方法是加強檢測器的敏感度。
為了解決活細(xì)胞成像低光照的問題，現(xiàn)在的數(shù)字CCD 相機檢測器更加敏感，這是通過面元劃分（binning）來實現(xiàn)的（如Figures 3 & 8所示）。一般CCD讀取像素點會將橫向上的像素值轉(zhuǎn)移到只讀寄存器上，然后進(jìn)行順序分析。在binning 處理時，相互臨近的一群光信號會被合在一起檢測（2 x 2 或 4 x 4）為一個信號值進(jìn)行輸出。這通過將多行像素轉(zhuǎn)移到一系列只讀寄存器（比如兩行進(jìn)行 2 x 2 binning ，四行進(jìn)行4 x 4 binning）中然后多行同時讀取來實現(xiàn)的。在2 x 2 binning 情況下，空間分辨率會降低一半，信號強度增加4倍，信噪比增加2倍。很明顯，雖然降低了空間分辨率，但對于弱信號強度的提高是很顯著的。
Figure 3顯示的是將臨近的像素結(jié)合在一起并不斷的增加binning 水平，對數(shù)字圖像的空間分辨率及zui終尺寸的影響。樣品為印度麂鹿皮膚組織的纖維原細(xì)胞，它表達(dá)mCherry 熒光蛋白（紅色偽彩）及人的β肌動蛋白，位于應(yīng)力纖維組成的絲狀細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)中。通常在進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記時，表現(xiàn)出很好的共定位的細(xì)胞常常表達(dá)很低水平的融合蛋白，其發(fā)出的信號極微弱。如果不用binning處理（Figure 3（a）），在不產(chǎn)生光毒性及光漂白的曝光時間下得到的信號弱到無法辨別。Binning 2 x 2 漸進(jìn)到 4 x 4增加了信號水平，但降低了空間分辨率（Figures 3（b） and 3（c））。在binning 8 x 8 像素下的圖像（Figure 3（d））zui亮。但分辨率降低極多。另外很重的一點是，在binning 處理時，增加合并像素點，圖像尺寸按比例縮小例如，不進(jìn)行binning 處理（1 x 1）的圖像（Figure 3）的原始大小為1360 x 1024 （pixels），在（2 x 2）, （4 x 4）, 及 （8 x 8） 處理條件下的圖像分辨率分別為680 x 512, 340 x 256, 及 170 x 128 （pixels）。如上所述，這些圖像的尺寸被縮小了。同樣的，一個512 x 512 的數(shù)碼相機在進(jìn)行上述比例處理時，圖像的大小將分別縮小為256 x 256, 128 x 128, and 64 x 64 （pixels）。
Binning 處理的重點是讀出噪音產(chǎn)生在binning 處理后，所以雖然讀取了幾個像素的集合，但是每個binning處理后的像素只讀取一次。相對的，像 2 x 2 這樣的像素集合，如果先收集信號再進(jìn)行平均計算，那么由于每個點都會產(chǎn)生噪音，這樣的結(jié)果會比binning差。因此，雖然binning處理會降低空間分辨率，但是這樣的處理可以顯著提高空間分辨率，這在光敏細(xì)胞的試驗中是非常有意義的，因為在這樣的試驗中，光照水平非常的低，而且曝光時間和很短。在活細(xì)胞成像中zui重要的參數(shù)通常是檢測若熒光信號的能力，而不是空間分辨率，所以，通過binning 處理提高敏感度及縮短曝光時間是成像的重點，不需太多考慮空間分辨率。除binning 處理外，許多相機通過小范圍拍攝或只拍攝感性的區(qū)域來縮短曝光時間，這種拍攝方法可以在保有空間分辨率的同時減少曝光對細(xì)胞的損害。
克服常規(guī)相機的缺點
為了滿足極低照明下高速成像的需求，開發(fā)商們推出了一種有效的放大弱信號的相機，EMCCD。這種EMCCD 通過芯片上益增寄存器進(jìn)行信號放大，敏感度能夠達(dá)到單光子檢測級別，同時不會像傳統(tǒng)CCD 一樣降低量子效率和空間分辨率。EMCCD 的一個顯著特性是，通過芯片上專門的外延串行寄存器，在硅亞結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生碰撞電離過程中進(jìn)行增益。（Figure 4）. 由光子激發(fā)出的電荷要高于讀出噪音，這即使在高幀頻下也能實現(xiàn)，并且對于現(xiàn)在的任何CCD 都使用，包括背照芯片CCD（back-illuminated CCD）。
EMCCD 的優(yōu)越性在于由于放大過程直接發(fā)生在CCD 的結(jié)構(gòu)內(nèi)，它要比其它的強化CCD（intensified CCDs）便宜一些。對于單分子成像，全內(nèi)反射，針孔碟片場掃描共聚焦離子通量檢測實時3D試驗等弱信號的測定，EMCDD 要比其它針對弱光的感光原件好很多。另外，如果使用傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)，EMCCD極高的敏感性可以在弱光及/或低激發(fā)強度下得到高信號強度，這樣，可以降低光毒性及熒光的光漂白。
顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)
用于活細(xì)胞成像的顯微鏡的結(jié)構(gòu)必需足夠堅固，或者是鋁制的，同時，也要足夠穩(wěn)固防震。而顯微鏡外露的光學(xué)表面及聚光鏡，燈箱，物鏡轉(zhuǎn)盤等裝置必需保持潔凈，存放顯微鏡的房間要保持低濕度的無塵狀態(tài)。在活細(xì)胞成像的日常使用時，必需保證所有的光學(xué)通路及光圈在同一軸線上，并應(yīng)用克勒照明。存放顯微鏡的房間也有相應(yīng)要求，室內(nèi)不要安裝頂燈，以減少直接進(jìn)入目鏡及樣品處的光線。
電子數(shù)字相機通常通過專用的接口接在顯微鏡的一個或幾個相機接口上。研究級的顯微鏡通常有多個接口同時連接幾個相機（如 Figure 1）。這對于需要使用不同手段得到*圖像效果的顯微成像是十分有用的。在顯微鏡機身內(nèi)部有一系列反光鏡，分光鏡，棱鏡分別被安置在恰當(dāng)的位置以將光信號反射到不同的相機接口及目鏡中。需要注意的是，由于部分光進(jìn)目鏡而減少了進(jìn)入相機接口的光線，相機成像的信噪比會降低。因此，在配置顯微鏡時，應(yīng)該將若熒光照相的分光口的分光率設(shè)置為100％。
物鏡負(fù)責(zé)收集由樣品發(fā)出的光線，并將其傳到顯微鏡的光學(xué)組件中，因此，物鏡的選擇是至關(guān)重要的。在光路中的光學(xué)組件，如反光鏡，分光鏡，聚光透鏡，濾光鏡，棱鏡等會嚴(yán)重的降低信噪比，所以，這種效應(yīng)必需降低。在熒光成像時，應(yīng)當(dāng)使用高數(shù)值孔徑的物鏡，因為它能夠盡可能多的收集由樣品發(fā)射出的光線。數(shù)值孔徑（Numerical aperture）體現(xiàn)了其棱鏡能夠從單一點光源收集光線的能力，因此，對于活細(xì)胞成像，數(shù)值孔徑是zui重要的考慮因素。其數(shù)值標(biāo)注在物鏡筒上，大小從0.25（低放大倍數(shù)，如10x干鏡）到1.20（水鏡）及1.45（油鏡，40x - 100x范圍）不等。數(shù)值孔徑的數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：
Numerical Aperture （數(shù)值孔徑，NA） = Refractive Index （折射率，η） × Lens Acceptance Angle （鏡口角的正弦值，sin（θ））
因此，物鏡對光的收集能力與物鏡前透鏡及樣品間介質(zhì)的折射率有關(guān)，與鏡口角的正弦值有關(guān)。數(shù)值孔徑為物鏡分辨率數(shù)學(xué)表達(dá)式的一個因數(shù)。根據(jù)瑞利判據(jù)（Rayleigh criterion，一種保守的估計），分辨率等于照明光波長與一個常數(shù)（1.61）的乘積與數(shù)值孔徑的商。另外，數(shù)值孔徑還決定了圖像的亮度，圖像亮度與數(shù)值孔徑的四次方成正比，與放大倍數(shù)的二次方成反比。所以，稍微提高數(shù)值孔徑都能夠顯著地提高信號強度。因此活細(xì)胞成像要求使用數(shù)值孔徑zui高的物鏡及高折射率的浸入物（油或水）。
如上，圖像的亮度與物鏡放大倍數(shù)的二次方成反比，因此弱信號成像使用低倍數(shù)的物鏡。比如說，在100x數(shù)值孔徑1.4的物鏡下觀察樣品，如果這個時候信噪比成為影響圖片質(zhì)量的主要因素，那么將物鏡轉(zhuǎn)換到60x或40x，則同樣的數(shù)值孔徑下圖片的亮度會得到顯著的提高。事實上，將60x/1.4與100x/1.4的物鏡進(jìn)行對比，對同一張熒光圖像成像，前者要比后者亮三倍。觀測強度也是衡量物鏡透光能力的一個因素。在某些試驗中，為了達(dá)到要求的放大率，通常要將放大與binning 處理借個起來。
在多重標(biāo)記的固定細(xì)胞試驗中（有時也能是活細(xì)胞試驗），具有色差及平場矯正的物鏡是的。然而不幸的是，復(fù)消色差物鏡和平場復(fù)消色差物鏡中相對于消色差物鏡和螢石物鏡（低度物鏡）來說，不可避免的添加了很多光學(xué)器件（透鏡）。高矯正的物鏡不會生成假象，可應(yīng)用于透射光技術(shù)，如相差，DIC等。然而，矯正的結(jié)果降低了光透過率，這對固定細(xì)胞的成像不會有很大的影響，但是對活細(xì)胞成像來說卻不然。闡述這種現(xiàn)象的例子是，一個40x/1.4的平場復(fù)消色差的物鏡，理論上要比同類100x物鏡亮六倍，但實際上，前者的亮度只有后者的四倍左右。但無論如何，40x及60x的物鏡在光學(xué)分辨率極限下，仍能提供zui亮的圖片。
如Figure 5 所示，為就圖像分辨率及亮度方面，物鏡數(shù)值孔徑的重要性。樣品為非洲綠猴的腎臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)物 （CV-1 line），用表達(dá)特異結(jié)合線粒體的EGFP 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下可以觀測到線粒體在細(xì)胞中的網(wǎng)絡(luò)分布。
Figure 5 為平場螢石物鏡下相同視野的圖片（數(shù)值孔徑1.3，放大倍數(shù)由40x到100x不等）。雖然圖中的拍攝條件及矯正手段相同，但40x下的線粒體要比其它條件的亮（Figure 5（a），圖片大小為經(jīng)調(diào)整）。相比之下，60x及100x下的圖片逐漸變暗，100x下的線粒體幾乎不可見 （Figures 5（b） & 5（c））.這樣的物鏡仍然可用，但是必需放大檢測器的增益值，這樣一來信噪比就會降低，圖片質(zhì)量也相應(yīng)下降。 需要注意的是，由于數(shù)值孔徑相同，從Figures 5（d）到5（f）的分辨率是一樣的。
以上的例子說明在選擇活細(xì)胞成像的物鏡時，如果樣品標(biāo)記熒光，則不要盲目的追求放大倍數(shù)。對共聚焦顯微鏡的40x或60x物鏡來說來說，在成像時進(jìn)行放大后的結(jié)果和100x物鏡的成像效果相同（Figures 5（d） and 5（e））。由于具有相同的數(shù)值孔徑，兩個物鏡的分辨率是一樣的。但這種說法并不是說60x或100x 的物鏡沒有任何作用。事實上，觀察小樣品通常要使用高倍數(shù)的物鏡，比如寬視場顯微鏡下觀察過氧化物酶體和分泌顆粒。由于圖像大小通常與檢測器的尺寸有關(guān)，所以，光學(xué)成像zui終的放大率取決于CCD的參數(shù)（像素點大小，中間變倍等）。因此，物鏡的選擇通常要考慮光學(xué)顯微鏡的配置，以及試驗的特殊要求。
信噪比比分辨率的影響更大的時候，要選擇矯正度低的物鏡，這樣的物鏡中光學(xué)原件更少，相對的光的透過率會顯著提高。同樣的，相差物鏡中的光學(xué)器件也會減少光的透過率。這種水平的減少在透射光成像時不會有影響，但是在熒光成像時大概會減少15 %-20％的光透率。因此，在進(jìn)行活細(xì)胞成像時，如果試驗用的熒光標(biāo)記較弱，則不能用相差物鏡，除非實驗步驟方面有特殊的要求。同樣的，當(dāng)試驗要求將熒光圖片同DIC圖片進(jìn)行疊加時，在熒光成像前要將物鏡下方的偏光裝置拿開，因為它大概會減少30％ 的透光率。
光路中的任何缺陷都會直接影響zui終成像的信噪比。對于活細(xì)胞成像來說必需消除高數(shù)值孔徑物鏡的球差。通常引起球差的因素有培養(yǎng)液及物鏡浸入物等。球差是由于光沿光軸不均勻分布造成的，會導(dǎo)致成像變形。由于成像樣品通常較大，球差還會影響信噪比。這個問題在對厚組織成像時要比薄層細(xì)胞成像時嚴(yán)重很多，由于水的折射率與培養(yǎng)基的折射率接近，通常使用水鏡來消除這個問題。另外一種方法是矯正因培養(yǎng)基或蓋玻片導(dǎo)致的折射率的改變。由于折射率會受溫度影響發(fā)生變化，所以，在室溫下與在37攝氏度下的浸入物及蓋玻片厚度需要做適當(dāng)調(diào)整。的物鏡可通過矯正環(huán)來消除溫度引起的折射率的改變。
如 Figure 6 所示，為顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)（a）及數(shù)碼相機檢測系統(tǒng)（b）對活細(xì)胞成像的影響。圖中樣品為鼠袋鼠腎臟的一個上皮細(xì)胞（PtK2 line），該細(xì)胞表達(dá)EGFP，EGFP與H2B組蛋白結(jié)合定位于細(xì)胞核。觀察方法為寬視場落射熒光。如圖，左圖右下方及右圖左下方為分辨率*的兩張。在活細(xì)胞顯微成像方面，光學(xué)系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑及光源的波長決定了圖像對比度與物理分辨率。在左圖中，隨著照明強度的增加，圖像中的噪音明顯減少；隨著光學(xué)分辨率的提高，細(xì)胞核中的細(xì)節(jié)變得更加清晰。
在右圖中，圖像質(zhì)量隨著灰度及空間分辨率改變。增大像素尺寸，圖像的細(xì)節(jié)變得模糊不清，圖像幾乎無法辨認(rèn)；而降低灰度，會改變圖像外形，并僅呈現(xiàn)出具有高對比度的信息。以上兩種因素共同改變圖像質(zhì)量，同樣，在活細(xì)胞成像試驗中以上因素需要根據(jù)試驗需要進(jìn)行配置。
在活細(xì)胞成像試驗中還應(yīng)用了各種濾色片及反光鏡，它們的作用是調(diào)整從照明器經(jīng)顯微鏡到檢測器中光的波長。在透射光系統(tǒng)中這些增稱光學(xué)組件包括起偏器，棱鏡（DIC），聚光鏡環(huán)，相差環(huán)等。在透射光成像系統(tǒng)中，如明視野，DIC，相差等，光的強度要比熒光大得多，所以，為了提高信噪比，需要在光路中添加一些組件。其中首要考慮的是過濾金屬鹵素?zé)舻淖贤饧凹t外波段的光以保護(hù)樣品。紅外線產(chǎn)生的熱效應(yīng)會損害細(xì)胞活性，并會降低紅外敏感CCD 成像的信噪比。紫外線很少出現(xiàn)在透射光源中，為了阻止這些波長范圍的光，只需添加綠光片或紅光片即可。紅外及可見光濾光片都會顯著降低光強，所以在成像時需要增加曝光時間及增益以保證適宜的信噪比。
在熒光成像中，為了保證激發(fā)光及發(fā)射光的波長在適宜的范圍內(nèi)，會在光路中添加濾光片及半透半反濾光片。在相對光強較低的熒光成像中，選擇濾光片首要考慮的是它是否能提供適宜的信噪比。大多數(shù)情況下，光會不分波長大量的通過光學(xué)組件以至于掩蓋了熒光染料發(fā)出的信號，這時帶通濾色片就顯得非常重要。通常這中窄波段的濾色片會限制絕大部分光透過，所以，為了得到滿意的圖片，研究人員必需選擇適宜帶寬的濾色片。
現(xiàn)在，市場上有很多廠商提供特制的帶通濾色片及半透半反濾色片組合。在為活細(xì)胞成像選擇濾片組時，為了得到好的信噪比，所選的組合要zui接近熒光子的光譜性質(zhì)。例如，選擇標(biāo)準(zhǔn)的多色熒光成像FITC 濾色片組專門為進(jìn)行YFP成像時，就不需要為了提高信噪比而濾掉部分YFP 范圍內(nèi)的光（Figure 7（a））。在這種情況下，選擇符合YFP 吸收及發(fā)射波段的帶通激發(fā)光濾色片及長通發(fā)射光濾色片會得到*的效果。
再舉一個兩個熒光蛋白衍生物波段的選擇實例（Figure 7）。圖中上部為YFP 的變種Venus 的激發(fā)及吸收光譜，它配合FITC 濾片組及寬波段發(fā)射光光譜以達(dá)到的信號收集效果。發(fā)射光濾色片的選擇與檢測器收集的信號直接相關(guān)，而上述組合顯然不如寬帶通YFP 組和收集的信號多。 同樣的，TRITC 濾片組（Figure 7（c））在mCherry 熒光蛋白的激發(fā)波段不如Texas Red 濾片組（Figure 7（d））效率高。另外，Texas Red 濾片組的發(fā)射光波段更寬，允許檢測器收集更多的信號。所以，在為活細(xì)胞成像選擇熒光基團時需要配合濾片組合一起考慮，以保證得到*的激發(fā)及發(fā)射信號。
現(xiàn)在有更多的帶寬組合可供多色熒光標(biāo)記同時成像。另外還需要考慮的是在顯微鏡光學(xué)組件中添加中性密度濾色片來降低激發(fā)及發(fā)射強度——這在活細(xì)胞成像中是重要的，如同阻擋或減少紫外，紅外線的細(xì)胞光毒性。這些濾色片通常放在顯微鏡光源接口處，并可以隨時取出以增加光強。通過顯微鏡的光強及數(shù)值孔徑可以通過聚光鏡或落射照明器的孔徑光闌及視場光闌進(jìn)行調(diào)節(jié)。
檢測器幾何形狀與光學(xué)分辨率間的匹配
由于樣品有檢測器成像，圖像的空間分辨率取決于光學(xué)系統(tǒng)的分辨率。因為CCD 的檢測器有一列光電二極管組成，每個都有固定的尺寸，所以，每個像素的幾何學(xué)特性限制了圖像的zui終的分辨率。為了達(dá)到顯微鏡的分辨率，檢測器的尺寸要符合Nyquist 抽樣標(biāo)準(zhǔn)——2.5-3 pixels/Airy disk unit。舉個例子，對于光學(xué)分辨極限250 nm，圖像zui終的像素大小應(yīng)接近80-100 nm。對活細(xì)胞成像來說，信噪比要比空間分辨率更重要，所以*的成像方式為2 pixels/Airy disk，這種方式不會對圖像質(zhì)量造成明顯損害。降低每個像素與Airy Unit的比例會增加圖像的亮度，并且可以使用更大的CCD 光電二極管，以累積更多的光電子。
Figure 8（a） 中描述的是應(yīng)用高數(shù)值孔徑物鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像時Airy disk 與CCD 像素列陣的投射關(guān)系。列陣中每個像素大小為6μm。100x/N.A.1.4 的物鏡投影在CCD表面上的像直徑為20μm（Table 1），因此，可以達(dá)到Nyquist 抽樣標(biāo)準(zhǔn)（3.3 pixels/Airy unit）。在這樣的采樣頻率下，有充足的空白可以進(jìn)行2x2 的binning 處理。相對的相同數(shù)值孔徑下60x 物鏡的投影直徑為12 μm，剛好低于Nyquist 的下限。另外，即使將數(shù)值孔徑降到1.3，40x 物鏡投影直徑仍只有8.4μm ，需要連接放大接口才能達(dá)到Nyquist 分辨率標(biāo)準(zhǔn)。光電二極管列陣的像素尺寸可大可小以匹配顯微鏡的空間分辨率，而無需添加中間變倍體；或者可以配置一個特制的CCD 接口，這樣的接口中包含了一系列棱鏡系統(tǒng)。
Figure 8（b） 中顯示的為2x2 binning處理的原理圖，列陣中包含16個像素。曝光后，CCD 收集的光電子將進(jìn)行兩次平行遷移，然后，串行寄存器上發(fā)生兩次遷移，這樣一個像素上將收集4個像素（2x2 binning）的光電子，并將其傳輸?shù)捷敵龉?jié)點進(jìn)行放大。4x4 binning 的處理方式與此相同，在處理過程中收集列陣中16 個像素信號并在輸出前進(jìn)行放大，這樣一來可以顯著地增強信號，同時降低讀出噪音。如前面討論過的，binning 處理是活細(xì)胞成像中一個的弱信號收集方式，這種處理可以降低對低熒光表達(dá)量細(xì)胞的毒害。
實際上，由1.4數(shù)值孔徑的物鏡成的像，zui終大小介于100-120 nm 之間。將這樣大小的信號一合適的物理尺寸轉(zhuǎn)移到CCD 光電二極管中，需要考慮物鏡的放大倍數(shù)。例如，要達(dá)到60x/1.4 物鏡的zui大分辨率，光電二極管不能大于6μm ——大小取決于放大倍數(shù)及分辨率。然而，對100x/1.4 的物鏡來說，光電二極管zui大可至10μm。因此可以很明顯的看出，只有當(dāng)CCD 的配合了適當(dāng)?shù)奈镧R，數(shù)字分辨率才會與光學(xué)分辨率相匹配。10μm光電二極管與100x 物鏡組合生成的圖片像素大小為100 nm；當(dāng)與60x 物鏡組合時生成的像素大小為167 nm，這時；圖片的分辨率會低一些。相比之下，6μm 光電二極管與60x 的物鏡配合則是*的，但是當(dāng)與100x物鏡組合時，則會取樣過度。這種情況下的取樣過度會降低圖像亮度，從而無法改善圖像分辨率。
從前面的討論看來，似乎想要得到理想的分辨率就得為不同的物鏡配不同的CCD。實際上，這種方法一點都不實際，所以，需要找到一個折衷的辦法。在有些情況下，這個問題可以通過在CCD 與顯微鏡之間添加一個耦合器來消除物鏡放大倍數(shù)造成的影響。例如，0.6x 的接口可以將100x 物鏡的投影大小降低到60x 物鏡的效果。通過售后經(jīng)銷商可以得到各種耦合器，可放大或縮小CCD 光電二極管上投影的大小。以上的建議中需要注意的是，這些組件添加或移除相對來說非常容易，不要把CCD 從顯微鏡接口處拿下來，以防灰塵或顆粒進(jìn)入顯微鏡機體內(nèi)或相機成像傳感器上。清潔傳感器是件非常困難的事，尤其是要*清除那上面的每一個灰塵及顆粒。
與顯微鏡光學(xué)分辨率相匹配的像素大小
Table 1
現(xiàn)在許多為熒光顯微鏡設(shè)計的CCD 的光電二極管大小在5-16μm 范圍內(nèi)，并可進(jìn)行binning 處理。如上討論，通過binning 處理，幾個光電二極管上的信息倍整合到一個單元中，從而有效的增大像素尺寸。6-8μm 大小的光電二極管可匹配60x 的物鏡，經(jīng)過2x2 binning 處理，可匹配100x 物鏡。這中情況下，使用高透過性的物鏡，可使100x 物鏡下成像更加明亮。這樣，100x 物鏡下，bin 2 下的圖片幾乎是60x 物鏡下，bin 1 圖片亮度的二倍，而分辨率近似或高于bin 1。當(dāng)要求更高的敏感度時，使用60x 物鏡進(jìn)行2x2 binning 處理可以增加圖像亮度，這時對于活細(xì)胞成像來說，分辨率上的損失在可接受范圍內(nèi)。
在一些實驗中，例如大群細(xì)胞的同時成像，獲得視野內(nèi)更多的信息要比空間分辨率重要。在沒有中間變倍體的情況下，CCD 的矩形傳感器無法獲取目鏡視野內(nèi)所有的信息，通常只有30-80% 左右，大小取決于芯片尺寸。如果要獲取更大的圖片，需要添加一個具縮小功能的耦合器（如前所述）。通常0.6x的透鏡就可以使整個視野內(nèi)的圖片投影到芯片上，但同時會降低一些分辨率。如果要保有圖像分辨率，可以通過x-y 掃描獲取多張圖片然后用軟件進(jìn)行拼接。
光學(xué)顯微鏡上使用近紫外光源來獲得zui高分辨率。近紫外后，分辨力的順序是藍(lán)，綠，紅。在大多數(shù)情況下，研究人員使用金屬鹵素?zé)舢a(chǎn)生的寬光譜進(jìn)行照明，但是在活細(xì)胞成像中，照明光譜通常被濾色片控制在很窄的波段?？梢姽庾V中部波長大約為550 nm，人眼zui敏感的綠色。Table 1 中的分辨率就是在這個波長下測定的。所以在不同波長下，這些值是不同的。數(shù)值孔徑也是重要因素，如表中所列，放大倍數(shù)相同的條件下，數(shù)值孔徑越高，分辨率越高。
總結(jié)
也許在活細(xì)胞成像中zui關(guān)鍵的就是在獲得zui高光學(xué)分辨率的同時平衡試驗中信號強度（降低放大倍數(shù)），分辨率（提高放大倍數(shù)）及細(xì)胞活性間的關(guān)系。研究人員還必需選擇盡量少的透鏡來配合光學(xué)放大及檢測器像素尺寸。配合不同物鏡（放大倍數(shù)及數(shù)值孔徑）的各種類型的中間變倍體都可以購買得到，以滿足弱光及高分辨率試驗的要求。在選擇物鏡放大倍數(shù)時，必需嚴(yán)格遵守Nyquist 分辨率標(biāo)準(zhǔn)。每個像素不得大于分辨率極限的一半；由于顯微鏡中衍射極限，工作距離通常不能小于50 nm。
活細(xì)胞成像用標(biāo)準(zhǔn)物鏡通常為10x 及40x 干鏡，及40x， 60x，100x 油鏡或水鏡。經(jīng)濟的低放大倍數(shù)的干鏡通常用來進(jìn)行初步檢測，比如找到細(xì)胞的位置，因此過高不需要光學(xué)矯正。然而浸潤鏡頭則需要高數(shù)值孔徑（油鏡1.3-1,4，水鏡1.2），及高光透過性。由于圖片采集與視場中部，多以高平常物鏡并沒有多大意義，而同時這樣的物鏡昂貴并且光透性比其它物鏡低。所有用于熒光成像的物鏡都需要用熒光珠檢驗其點擴散函數(shù)。
無論落射熒光還是透射光（DIC 及相差），單色冷CCD 是成像的*選擇，這包括培養(yǎng)中的活細(xì)胞。在選擇相機時需要考慮的是量子效率，噪音水平（暗電流及讀出噪音），像素大小（及滿肼容量），及掃描頻率。為了減少光對樣品的損害，當(dāng)選擇高敏感度的相機，即高量子效率，低噪音，大像素尺寸，和低掃描頻率。因此，敏感度還需與分辨率（高分辨率，低像素尺寸）及顯像率（高掃描頻率）之間平衡。
低掃描CCD 的幀速率通常不高，因此，除非樣品的亮度*，在低曝光條件下信噪比會很低。這些因素都限制了CCD 在高速成像中的應(yīng)用（30幀/s），并是樣品成像變得令人挫敗。另外還需避免光漂白及光毒性，一些產(chǎn)品在拍攝時可以在細(xì)胞活性與亮度之間取得平衡。處于以上考慮，相機應(yīng)無光閘，具幀轉(zhuǎn)移或插值傳感器，這樣除了低速數(shù)字信號掃描外，可以持續(xù)地在錄像速率下拍攝圖像。在熒光探針亮度很低或量子產(chǎn)量很低等極弱光條件下，如果要求高速成像，可選擇增益型或電子擴增型CCD。