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食品中致病菌的檢測方法研究進展
閱讀：815 發(fā)布時間：2016-12-91 免疫學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測依據(jù)免疫學(xué)理論和技術(shù)，基于抗原抗體反應(yīng)，從而設(shè)計抗原、抗體、免疫細胞、細胞因子的檢測分析方法。微生物表面具有其特異的抗原，并能激發(fā)機體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體；通過抗體結(jié)合表面抗原位點反應(yīng)前后的信號變化，檢測目標物；其中，借助標記物進行間接檢測的研究，得到了快速的發(fā)展和檢測效果的改善。近年來，發(fā)展較快的免疫檢測方法有如下四類。
1.1 酶聯(lián)免疫吸附法
酶聯(lián)免疫吸附分析法的關(guān)鍵點是酶標記，利用標記酶對底物的催化性能，將信號進行放大，從而達到靈敏檢測致病菌的目的。在檢測時，常借助抗原抗體間的特異性，通過三明治夾心結(jié)構(gòu)將酶引入體系，此時載體上的酶量與待測菌的量呈現(xiàn)一定的比例。加入酶的催化底物，酶與底物反應(yīng)后所形成產(chǎn)物的量與待測菌的量呈現(xiàn)一定的關(guān)系，因此只要檢測出產(chǎn)物的量就可以定性或定量檢測致病菌。由于酶有較高的催化效率，間接放大了免疫檢測信號，該類檢測方法具有較高的靈敏度。
1.2 熒光免疫檢測法
1941年，Coons等將熒光素用作標記構(gòu)建檢測體系。經(jīng)過發(fā)展，該類方法的標記物拓展到其它熒光活性分子，標記對象主要為抗原、抗體，在免疫反應(yīng)結(jié)合后，通過熒光成像、熒光光度計等檢測標記物的熒光信號，間接表示目標物含量。該類方法在可視化檢測領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。
1.3 免疫膠體金標記分析法
免疫膠體金標記技術(shù)主要包括膠體金光鏡染色法、斑點金免疫滲濾法和膠體金免疫層析法。它是一種將膠體金標記技術(shù)、層析分析技術(shù)以及免疫檢測相結(jié)合的快速檢測技術(shù)。c# 圖像識別其原理是依靠抗原與抗體的特異性結(jié)合，zui終使膠體金變色，從而達到定性或定量檢測目的。在檢測時，將抗原滴至加樣孔膜上與金標抗體結(jié)合，在吸水材料的牽引下沿試條展開，到達檢測線時由于特異性結(jié)合形成兩個抗體結(jié)合一個抗原的復(fù)合物，由于金顆粒的沉淀，因此檢測線呈紅色。未結(jié)合抗原的抗體行至對照線，與上邊的抗體結(jié)合，使得對照的線呈現(xiàn)紅色，出現(xiàn)兩條紅線。若不含有目標致病菌則不發(fā)生結(jié)合，檢測線不變紅色，zui終只出現(xiàn)一條紅線。
1.4 免疫磁珠技術(shù)
免疫磁珠分離技術(shù)將磁性分離與免疫反應(yīng)相結(jié)合，從而構(gòu)建免疫學(xué)檢測技術(shù)；首先在磁珠上包被抗體，再與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，將目標菌進行識別分離，zui后磁力富集。該類方法特異性強、靈敏度高、反應(yīng)時間短。如果將免疫磁珠分離技術(shù)與快速檢測技術(shù)相結(jié)合，可以將致病菌檢測時間由傳統(tǒng)的幾天縮短到幾小時，因此，在食源性致病菌檢測中，免疫磁珠技術(shù)具有廣闊的發(fā)展空間。
2 分子生物學(xué)檢測技術(shù)
核酸生物分子作為生命體的基本單元，負責(zé)遺傳信息的編碼、傳輸及表達，作用非常重要。它由核苷酸組成，根據(jù)化學(xué)組成不同分為核糖核酸（簡稱RNA）和脫氧核糖核酸（簡稱DNA）。目前已有的核酸擴增技術(shù)分為兩大類：靶核酸的直接擴增與信號放大擴增。靶核酸直接擴增包括聚合酶鏈式反應(yīng)、鏈替代擴增、連接酶鏈式反應(yīng)和核酸依賴擴增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增和滾動環(huán)擴增；另一類是信號放大擴增：包括支鏈DNA、侵染探針和滾動環(huán)擴增等。分子生物學(xué)方法在致病菌檢測領(lǐng)域，得到了很好的應(yīng)用[7]。
2.1 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）
1985年，Mullis等人發(fā)明了PCR技術(shù)，相對而言，PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度好、操作簡單、重復(fù)性好的優(yōu)點。PCR是一種DNA體外復(fù)制技術(shù)，通過復(fù)制放大，擴增目標互補DNA片段，以微量的DNA為起點，獲得大量的復(fù)制DNA。PCR的基本原理和DNA復(fù)制過程相似，其特異性依賴于靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。一般分為三個階段：加熱模板DNA發(fā)生變性；冷卻使模板DNA與引物互補序列配對結(jié)合；在適度的溫度下進行引物的延伸。重復(fù)這三個過程能獲得更多半保留復(fù)制鏈，從而能在短時間內(nèi)將目的基因擴增放大幾百萬倍，PCR技術(shù)主要應(yīng)用于單管PCR產(chǎn)物的實時熒光檢測。
2.2 連接酶鏈式反應(yīng)（LCR）
1987年，Backman研究發(fā)明了LCR方法技術(shù)。1991年，Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶延伸了LCR試驗，為LCR的實用發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。LCR技術(shù)依靠堿基的互補配對原理開展檢測，在DNA連接酶的作用下，通過連接與模板DNA互補的兩個相鄰寡核苷酸鏈，進行DNA片段的快速擴增，從而復(fù)制出大量靶基因。
2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）
2000年，Notomi等提出LAMP技術(shù)，LAMP技術(shù)依靠能對靶序列上的6個獨立區(qū)域特異性識別的4種引物，及具有鏈置換活性的DNA聚合酶，通過循環(huán)鏈置換反應(yīng)，達到靶序列的擴增。反應(yīng)包括兩個階段，循環(huán)擴增始發(fā)物的形成與循環(huán)延伸。首先，由外部引物擴增出內(nèi)部引物所需的模板，接著內(nèi)部引物對靶基因片段進行引導(dǎo)合成。如此循環(huán)反應(yīng)zui終形成帶有類似花椰菜的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該法可在短時間內(nèi)實現(xiàn)109—1010倍的擴增。Malcolm等結(jié)合多重PCR技術(shù)和LAMP方法，構(gòu)建了副溶血性弧菌的定量檢測體系[9]。Lee結(jié)合LAMP和免疫層析技術(shù)，以未前處理的全血和牛奶為檢測對象，實現(xiàn)了*和大腸桿菌O157：H7的檢測[10]。LAMP方法是一種快速簡便、省時省力、特異性好、靈敏的致病菌檢測技術(shù)。