慶大霉素快檢試劑盒
慶大霉素快檢試劑盒
使用說(shuō)明書
1、原理
微孔板用羊抗兔抗體IgG包被。特異性抗體（兔抗慶大霉素），慶大霉素標(biāo)記的酶（酶結(jié)合物）和慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品或應(yīng)聘被加入到微孔后，特異性抗體被牢固地集合在板條上的羊抗兔抗體IgG上，同時(shí)，游離的慶大霉素（在標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品中）和酶結(jié)合物與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。孵育后，在洗滌步驟中除去非結(jié)合（酶標(biāo)記）試劑。加入色原底物（四甲基聯(lián)苯胺），結(jié)合的酶結(jié)合物可將無(wú)色的色原轉(zhuǎn)化成為有色色產(chǎn)物。加入硫酸，終止底物反映，在450nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值，與樣品中的慶大霉素濃度成反比。
2、產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒包含EIA測(cè)試所需試劑和標(biāo)準(zhǔn)品，可進(jìn)行96樣測(cè)試，用于牛奶、組織、血清、尿樣、蛋類、蜂蜜和飼料樣品中中慶大霉素的篩檢。
慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素。氨基糖苷類抗生素引起人類和動(dòng)物前庭功能障礙和耳聽力損害。氨基糖苷類抗生素具有抗細(xì)菌及抗真菌作用，可用于治療革蘭氏陰性菌引起的嚴(yán)重感染，因此仍在廣泛使用。但氨基糖苷類抗生素的治療劑量及中毒劑量較為接近，其使用劑量必須收到監(jiān)控。人類在飼養(yǎng)過(guò)程中為防止奶牛間疾病的傳染、避免禽類消化器官和呼吸道疾病的爆發(fā)有意或無(wú)意使用的氨基糖苷類抗生素從而在動(dòng)物器官中產(chǎn)生了氨基糖苷類抗生素的殘留。
3、靈敏度和交叉反應(yīng)
交叉反應(yīng)
慶大霉素 100% 紫蘇霉素 20% 妥布霉素 <0.1%
新霉素 <0.1% 卡那霉素 <0.1% 林可霉素 <0.5%
靈敏度：測(cè)試曲線線性范圍0.1～-8.1ng/ml
慶大霉素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)下限：
樣品 處理方法 檢測(cè)下限
牛奶 脫脂稀釋 2ppb
組織 三氯yi酸提取 3ppb
血清 緩沖液稀釋 2 ppb
蛋類 緩沖液稀釋 1 ppb
蜂蜜（稀釋法） 緩沖液稀釋 3 ppb
蜂蜜（抽提法） 固相抽提 0.5 ppb
尿樣 緩沖液稀釋 2 ppb
飼料 三氯yi酸提取 2 ppb
4、試劑盒保存
2-8℃暗處保存
使用前應(yīng)先將試劑平衡至室溫，再重組或稀釋試劑盒組分。
應(yīng)避免陽(yáng)光對(duì)色原底物溶液的直接照射。
若觀察到下列現(xiàn)象，便說(shuō)明試劑已發(fā)生降解:
色原溶液在諸如反應(yīng)孔以前變藍(lán)。
z高結(jié)合時(shí)顏色反應(yīng)微弱或缺如。（零標(biāo)準(zhǔn)，E450 nm<0.8）
5、慶大霉素檢測(cè)試劑盒試劑盒組分
96孔酶標(biāo)版（12條*8孔）預(yù)包被抗體，無(wú)需洗滌
樣品稀釋液：20ml，50倍濃縮
洗滌緩沖液：50ml，20倍濃縮
底物溶液緩沖液A：7ml，即時(shí)可用
底物溶液B：7ml，即時(shí)可用
終止液：7ml，即時(shí)可用
酶結(jié)合物溶液：7ml，即時(shí)可用
6瓶慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：各1ml，濃度為0、0.1、0.3、0.9、2.7和8.1ng/ml
檢測(cè)所需設(shè)備和材料：
酶標(biāo)儀（450nm）：冷凍離心機(jī)；混合振蕩器；移液器；勻質(zhì)器；微量移液器（20-200ul,100-1000ul）;移液器（205ml）；天平、量筒、塑料檢測(cè)管、鋁箔或封口膜
6、注意事項(xiàng)
終止溶液含硫酸，切勿接觸皮膚。
全部生物材料勻應(yīng)避免接觸皮膚和粘膜。
底物TMB在接觸皮膚和吞入時(shí)有吸入毒性，在處理此種底物時(shí)應(yīng)小心謹(jǐn)慎。
不得失效期后的試劑盒組分，也不得混合使用不同批次的組分。
各板孔z后均用于測(cè)定光學(xué)曲線，應(yīng)防止孔底內(nèi)外遭受污損。
全部組分均在使用前*溶解，應(yīng)特別注意底物，此化合物可在4℃時(shí)結(jié)晶。
7、樣品處理
7.1 牛奶
2000g，4℃離心10min
去除上層脂肪
講脫脂奶樣用樣品稀釋液10被系數(shù)，充分混勻，調(diào)ph值為7.4±0.4
吸取50ul用于檢測(cè)。
7.2 組織
取1g均質(zhì)組織樣品（肉，肝或腎），加入3ml 3%的三氯yi酸，均質(zhì)1min，顛倒混勻樣品30min;
離心（2000g,4℃ 10min）；
除去上層脂肪,吸取200ul清液，加入800ul樣品稀釋液，混勻；
調(diào)整PH值到7.4±0.4；
吸取50ul用于檢測(cè)。
7.3 血清
血清用樣品稀釋液稀釋20倍后使用
吸取50ul用于檢測(cè)
7.4蜂蜜
7.4.1 緩沖液稀釋
城區(qū)1g均質(zhì)的蜂蜜樣品于塑料試管中
加4ml樣品稀釋液，渦旋混合均勻
靜置一會(huì)分層，吸取1ml上層干凈液體加到4ml樣品稀釋液中，渦旋混合均勻。
吸取50ul用于檢測(cè)
7.4.2 抽提法
1g蜂蜜樣品中加9ml抽提緩沖液
室溫下混合10min，離心（2000g,10min）
Sep-pakC18柱（water公司，05910）依次用10ml去離子水、5ml甲醇、10ml去離子水活化柱子。
將5ml樣品上清液過(guò)柱，用5ml去離子水洗滌柱子
真空干柱
用1ml甲醇洗脫
40℃ 氮硫蒸發(fā)甲醇
樣品殘留物溶于5ml樣品稀釋液
吸取50ul用于檢測(cè)
7.5 蛋類樣品
均質(zhì)后的全蛋、蛋白或蛋黃
吸取1ml均質(zhì)后的樣品到干凈試管中
加9ml樣品稀釋液，渦旋混合均勻
吸取50ul用于檢測(cè)
7.6 尿樣
將尿樣用樣品稀釋液稀釋10被倍，充分混勻，調(diào)PH值為7.4±0.4
吸取50ul用于檢測(cè)
7.7 飼料樣品
稱取1g均質(zhì)的飼料樣品，加5ml3%的三氯yi酸溶液，均質(zhì)1min，顛倒混勻樣品30min;
去掉塞子，離心 （2000g,10min）
出去上層脂肪，用過(guò)濾管吸取100ul清液（避免吸入脂肪）于塑料試管中，加入900ul樣品稀釋液后，混勻；
調(diào)整PH到7.4±0.4
吸取50ul用于檢測(cè)
8.慶大霉素檢測(cè)試劑盒試劑制備
使用之前應(yīng)先將試劑盒回復(fù)至室溫20-25℃（提前15-30min從冰箱去除即可）
8.1 微孔板
剪開塑料袋，取出需用數(shù)量的微孔板及框架。將不用的微孔板條放回備有干燥機(jī)的塑料袋內(nèi)，密封保存于2-8℃。
8.2洗滌緩沖液（20*濃縮）
稀釋的洗滌緩沖液應(yīng)在臨用時(shí)現(xiàn)配。如：2ml濃縮的洗滌緩沖液 38ml蒸餾水
8.3 樣品稀釋緩沖液（10*濃縮）
稀釋液應(yīng)在臨用時(shí)現(xiàn)配。如：2ml濃縮的洗滌緩沖液 18ml蒸餾水
8.4 底物溶液
使用前恢復(fù)至室溫，避免陽(yáng)光直射，用前充分搖勻（底物溶液在4℃
下易結(jié)晶）。
8.5 蜂蜜抽提緩沖液
10.1g（50Mm）1-庚烷磺酸（sigmaH27660）,11.4g（30mM）Na3PO4·12H2O.用去離子水定容到1升。（用Na3PO4 調(diào)PH2.0）
9、慶大霉素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)步驟（室溫20-25℃下操作z佳）
9.1 將所需數(shù)量的孔條插入微孔架
9.2 每孔從底部先加入50ul標(biāo)準(zhǔn)品或已處理好的樣品，再分別加入50ul酶結(jié)合物于相應(yīng)孔中
9.3封板，搖板1min
9.4 37（±1℃）孵育30min
9.5 洗版：將微滴板上端朝下倒空各孔后，再平穩(wěn)快速向下垂直甩動(dòng)，并將微孔架倒置在吸水紙上拍打以除去孔中的液體。用洗滌緩沖液（300ul/孔）注入全部板孔，再次倒掉微孔中液體。重復(fù)上述操作3遍。如使用自動(dòng)洗板機(jī)，可預(yù)定洗板完成5次周期。
9.6 將100ul混合后的底物溶液加入各孔。37℃暗處溫育10min。
9.7 將50ul終止液加入各孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450nm/630nm檢測(cè)），測(cè)定每孔OD值。
10、慶大霉素檢測(cè)試劑盒結(jié)果判定
1.計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的百分吸光度值，按下式計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)品或樣品O.D
*100%=各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）吸光度值%
零標(biāo)準(zhǔn)O.D
2.繪制以各標(biāo)準(zhǔn)品慶大霉素濃度為半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)的曲線圖，即縱坐標(biāo)標(biāo)書標(biāo)準(zhǔn)百分吸光值，橫坐標(biāo)表示各標(biāo)準(zhǔn)品慶大霉素濃度（ng/ml）的對(duì)數(shù)。在含量0.1-8.1ng/g范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為線性。
3.各樣品濃度可根據(jù)其百分吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，并乘以相應(yīng)的稀釋系數(shù).
樣品 稀釋倍數(shù) 慶大霉素的實(shí)際濃度
牛奶 10 校正曲線上讀出的濃度值*10
組織 20 校正曲線上讀出的濃度值*20
血清 20 校正曲線上讀出的濃度值*20
蛋類 10 校正曲線上讀出的濃度值*10
蜂蜜（稀釋法） 25 校正曲線上讀出的濃度值*25
蜂蜜（抽提法） 1 校正曲線上讀出的濃度值*1
尿樣 10 校正曲線上讀出的濃度值*10
飼料 50 校正曲線上讀出的濃度值*50
