生物固體微波殺菌及機理研究

微波加熱原理
　　波是頻率從300MHz～300GMHz的電磁波，其方向和大小隨時間作周期性變化。微波與物料直接作用，將超高頻電磁波轉(zhuǎn)化為熱能的過程即為微波加熱過程。水是強烈吸收微波的物質(zhì)，物料中的水分子是極性分子，在微波作用下，其極性取向隨著外電磁場的變化而變化，915MHz的微波 可使水分子每秒運動18.3億次，致使分子急劇磨擦、碰撞，使物料產(chǎn)生熱化和膨化等一系列過程而達到微波加熱目的 

微波殺菌機理

微波殺菌是微波的熱效應(yīng)和生物效應(yīng)共同作用的結(jié)果。微波對細(xì)菌的熱效應(yīng)是使蛋白質(zhì)變性，使細(xì)菌失去營養(yǎng)、繁殖和生存的條件而死亡；生物效應(yīng)是微波電場改變細(xì)胞膜斷面的電位分布，影響細(xì)胞周圍電子和離子濃度，從而改變細(xì)胞膜的通透性能，細(xì)菌因此營養(yǎng)不良，不能正常新陳代謝，細(xì)菌結(jié)構(gòu)功能紊亂，生長發(fā)育受到抑 制而死亡。此外，決定細(xì)菌正常生長和穩(wěn)定遺傳繁殖的核酸（RNA）和脫氧核糖酸（DNA），是由若干氫鍵緊密連接而成的卷曲形大分子。足夠強的微波場可以導(dǎo)致氫鍵松馳、斷裂和重組，從而誘發(fā)遺傳基因突變，或染色體畸變，甚至斷裂。 微波加熱主要特點：1、加熱迅速、
　　微波加熱與傳統(tǒng)的加熱方式不同，不需熱傳導(dǎo)過程，它是使被加熱物料本身成為加熱體，因此即使是熱傳導(dǎo)性較差的物料，也可以在極短的時間內(nèi)達到加熱溫度。
2、均勻

無論物體各部位形狀如何，它是使物料表里表里同時均勻滲透電磁波而產(chǎn)生熱能，不受物體形狀限制，所以加熱更均勻，不會出現(xiàn)外焦內(nèi)生的現(xiàn)象

3、節(jié)能高效
　　由于含有水份的物質(zhì)極易吸收微波而發(fā)熱，因此，除少量的傳輸損耗外幾乎無其它損耗。微波加熱與遠紅外加熱相比，節(jié)約能源1/3以上。
4、防霉殺菌，不破壞物料營養(yǎng)成分
　　微波加熱具有熱力效應(yīng)和生物效應(yīng)，因此，能在較低溫度下殺死霉菌和細(xì)菌；傳統(tǒng)加熱方式加熱時間較長，造成營養(yǎng)成分損失較大，而微波加熱迅速，能zui大限度地保存物料的活性和食品中的營養(yǎng)成份。

5、工藝*，可連續(xù)生產(chǎn)
　　只要控制微波功率即可實現(xiàn)加熱或終止。應(yīng)用PLC人機界面可進行加熱工藝過程規(guī)范的可編程自動化控制，它有完善的傳送系統(tǒng)，可確保連續(xù)化生產(chǎn)，節(jié)省勞力。

6、安全無害
　　微波是控制在金屬制成的加熱室內(nèi)工作，微波泄漏被有效抑制，不存在放射線危害及有害氣體的排放，不產(chǎn)生余熱和粉塵污染，極不污染實物也*。

城市生活污水中病原物種類繁多，zui常見的為腸道細(xì)菌、蠕蟲寄生蟲及病毒，其它（如真菌類、變形蟲屬等）則極少。這些病原物在污水處理過程中，大部分被保留或結(jié)合在生物固體顆粒物上，從而得到濃縮，其數(shù)量比污水中的數(shù)量要高得多。      生物固體作為農(nóng)肥或土壤改良劑是目前主要的生物固體有效利用處置方法。要防止生物固體施用過程中對環(huán)境造成病原物污染，zui有效的措施就是減少生物固體中病原物的數(shù)量。我國農(nóng)田灌溉水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB5084-92）規(guī)定：糞大腸桿菌菌群數(shù)應(yīng)小于10000個/L，蛔蟲卵數(shù)應(yīng)不超過2個/L，該標(biāo)準(zhǔn)指出灌溉水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)也適用于農(nóng)用的生物固體，因此生物固體的殺菌處理應(yīng)達到此項標(biāo)準(zhǔn)。      目前常用的生物固體殺菌處理方法有厭氧消化、自然干燥堆肥和熱處理。厭氧消化殺菌效果不能達到農(nóng)用標(biāo)準(zhǔn)，自然干燥堆肥殺菌時間長，熱處理的效率一般。微波殺菌是制造一個物理環(huán)境使微生物死亡，這個環(huán)境包括熱力的溫度場和頻率*的交變電磁場。兩種物理場共同作用于生物固體中的微生物，從而達到殺菌的效果，克服了上述幾種方法的不足。同時，微波對腸道細(xì)菌、蠕蟲寄生蟲和部分病毒都有殺菌作用，具有良好的應(yīng)用前景。      大腸桿菌在自然界分布很廣，是人和動物腸道中的正常菌群，正常情況下一般不會致病，但它是條件致病菌。本實驗以糞大腸桿菌作為指示菌，比較了微波殺菌和傳統(tǒng)加熱殺菌后生物固體中糞大腸桿菌菌群數(shù)的變化，通過酶活性檢測和透射電鏡觀察，進一步探討了微波殺菌的機理。1試驗過程與方法1.1試驗條件   試驗設(shè)備為經(jīng)過改裝的微波爐，其腔體截面積為29cm×26cm，試驗時，微波頻率為2450MHz。1.2加熱殺菌后糞大腸桿菌菌群數(shù)變化的檢測    取500g含水率為60%的生物固體，攤鋪于表面皿中，物料厚度1cm，置于恒溫烘箱中，記錄生物固體的溫度剛好達到烘箱設(shè)定溫度所需的時間。選擇3種不同的溫度（分別對應(yīng)于3種不同功率處理5min的溫度），從生物固體達到烘箱設(shè)定溫度時開始記時，選擇4種加熱時間（5min、10min、20min、30min）進行殺菌處理，測定糞大腸桿菌菌群數(shù)。1.3微波殺菌后糞大腸桿菌變化的檢測    取500g初始含水率為60%的生物固體，攤鋪在微波爐托盤上，物料厚度1cm，選擇3種微波輸出功率（100W、300W、600W），5種不同的輻照時間（1min、2min、3min、4min、5min）在SL-800微波爐中進行處理，處理結(jié)束時迅速打開爐門測量載體的溫度，并測定處理前后試樣的糞大腸桿菌菌群數(shù)。1.4糞大腸桿菌菌群數(shù)檢測方法    由含有N、P、S、K、Na等元素的無機鹽、微量乳糖、微量蛋白胨、損傷型大腸桿菌復(fù)蘇劑、雜菌抑制劑、酶底物及微量元素混合液等按比例配成培養(yǎng)基。采用兩種不同的特定酶底物：鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）和4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸（MUG），分別與占糞大腸桿菌90%的埃希氏大腸桿菌產(chǎn)生的葡萄糖苷酸酶起反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可辨的黃色產(chǎn)物鄰硝基酚和在360nm紫外線照射下閃現(xiàn)藍色熒光的4-甲基傘形酮水解產(chǎn)物。通過觀察經(jīng)24h 37℃培養(yǎng)后的水樣的顏色變化及紫外線照射下的熒光現(xiàn)象，判斷所檢測水樣中糞大腸桿菌菌群數(shù)的含量水平。    采用“4排20孔法”，以無本底藍色熒光的玻璃試管為容器，每份水樣平行做兩份各20管，即在4排試管中分別加入原水樣、10倍、100倍稀釋水樣和空白樣對照液，取液量均為1ml，同時各加入培養(yǎng)基1ml及相應(yīng)量的酶底物，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24h后，觀察并記錄每份水樣中糞大腸桿菌菌群數(shù)（MPN值）。1.5透射電鏡觀察   取未處理生物固體試樣、微波殺菌處理6min和12min的生物固體試樣各1g，加10ml無菌蒸餾水，混勻5min，倒出上清液，以400r/min離心分離10min，取分離后的沉淀制成標(biāo)本，以透射電鏡生物樣本制備法［4］對標(biāo)本進行固定，用丙酮逐級脫水后，再以環(huán)氧樹脂包埋，做成超薄切片。用醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染，在透射電鏡下觀察。1.6酶活性檢測    取未處理生物固體試樣、微波殺菌處理6min和12min的生物固體試樣各1g，加10ml無菌蒸餾水洗滌，洗滌液靜置5min，倒出上清液，用0.03mol/L磷酸鹽緩沖液（Ph=7.4）稀釋，在玻片上涂片。經(jīng)Pearse標(biāo)準(zhǔn)法［5］處理后，在顯微鏡下觀察乳酸脫氫酶（LHD）、輔酶Ⅱ（NADH）與細(xì)胞色素氧化酶（CCO）的變化。2結(jié)果與討論2.1微波殺菌和加熱殺菌效果的比較    將試驗得到的糞大腸桿菌菌群數(shù)轉(zhuǎn)換成對數(shù)值lgR，以處理時間為橫坐標(biāo)，lgR為縱坐標(biāo)作圖（圖1、圖2）。由圖1和圖2可知，100W微波功率條件下處理5min時，生物固體試樣的溫度剛剛達到35℃，此時殘留菌群數(shù)的lgR值為4.27，而生物固體在35℃干熱條件下，持續(xù)處理5min時殘留菌群數(shù)的lgR值為4.53。600W微波功率條件下處理5min時，生物固體的溫度剛剛達到90℃，殘留菌群數(shù)的lgR值為0.65，而生物固體在90℃干熱條件下，持續(xù)處理10min時殘留菌群數(shù)的lgR值為4.38，兩者的糞大腸桿菌菌群數(shù)相差4個數(shù)量級。同時，在300W以上功率的微波輻照下，生物固體輻照4min后，糞大腸桿菌菌群的lgR值已小于3，達到農(nóng)用控制標(biāo)準(zhǔn)4的要求。而在90℃下，生物固體加熱25min，lgR值仍未達到農(nóng)用控制標(biāo)準(zhǔn)。說明微波殺菌的效果要遠好于傳統(tǒng)的加熱殺菌。　   2.2微波殺菌的非熱效應(yīng)機制    電磁場作用于生物體，能引起兩類生物效應(yīng)：一類是熱效應(yīng)，指溫度升高并由此而引起生理和病理變化的作用，這是生物體內(nèi)各層次的生物物質(zhì)吸收電磁波后轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮苤?；還有一類為非熱效應(yīng)，指電磁場通過使生物體溫度升高的熱作用以新的方式改變生理生化過程的效應(yīng)。微波作用能改變生物性排列聚合狀態(tài)及其運動規(guī)律，而且微波場感應(yīng)的離子流，會影響細(xì)胞膜附近的電荷分布，導(dǎo)致膜的屏障作用受到損傷，產(chǎn)生膜功能障礙，從而干擾或破壞細(xì)胞的正常新陳代謝功能，導(dǎo)致細(xì)菌生長抑制、停止或死亡。再則細(xì)胞中的核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）在微波場力作用下可導(dǎo)致氫鍵的松弛、斷裂或重組。誘發(fā)基因突變或染色體畸變，從而影響其生物活性的改變，延緩或中斷細(xì)胞的穩(wěn)定遺傳和增殖。    從分子運動觀點考慮，溫度實質(zhì)是指分子熱運動的劇烈程度，溫度越高，分子熱運動程度越劇烈，表明熱力強度越大。傳統(tǒng)加熱殺菌實際上是熱力強度造成細(xì)菌致死，而不是熱量致死，它不能單純從能量的數(shù)量轉(zhuǎn)換來解釋。同樣，微波殺菌的作用，除了有熱力強度致死因素，還有電磁輻照改變細(xì)菌生態(tài)活動致死的因素。細(xì)菌被微波輻照時所處的物理環(huán)境既包括溫度場，也包括電磁場。在電磁場中細(xì)菌能出現(xiàn)電性質(zhì)的強烈反應(yīng)，例如，細(xì)胞內(nèi)水分子作為電極性分子，在交變電磁場中出現(xiàn)隨磁場頻率變化的電極性振蕩，電容性的細(xì)胞膜將被擊穿而破裂。    用回歸法計算微波殺菌和加熱殺菌D值（圖1和圖2直線斜率的負(fù)倒數(shù)）。   由表1和表2可知，D值越小，殺菌速率越快，效果越好。100W微波功率下的D值（35.6）比60℃干熱條件下的D值（48.3）小，到300W和600W微波功率下D值更小，相差得更大?！?    由此可見，微波殺菌除了溫度場的作用外，由于電磁場的存在，生物固體達到同樣溫度條件時，微波殺菌的效果明顯好于加熱殺菌，微波的滅菌速率也明顯比加熱殺菌快得多。說明微波殺菌過程中存在電磁場的非熱效應(yīng)。2.3透射電鏡觀察結(jié)果    在透射電鏡下觀察，正常大腸桿菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜完整、光滑，細(xì)胞壁緊貼細(xì)胞膜，細(xì)胞漿內(nèi)容均勻，見圖3（a）。經(jīng)微波殺菌處理6min后菌體變形，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間空隙增寬，細(xì)胞壁表面出現(xiàn)皺褶并部分模糊不清，細(xì)胞漿內(nèi)容物不均勻，見圖3（b）。微波處理10 min后，生物固體的含水率降低到40%以下，這樣的變化更加明顯，見圖3（c）。 2.4酶活性檢測    顯微鏡下觀察LHD、NADH、CCO3種酶的結(jié)果為：LHD與NADH均為蘭色，CCO為棕褐色。   經(jīng)微波殺菌處理6min后（含水率53.5%）的染色涂片，3種酶的染色均較淺；微波處理12min后（含水率30.2%），樣品染色涂片幾乎無色。這表明，3種酶的活性近乎喪失。由此可以推斷：微波通過抑制或破壞細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶、輔酶Ⅱ與細(xì)胞色素氧化酶等與生物氧化、呼吸代謝及能量產(chǎn)生有關(guān)的酶的活性，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。3結(jié)論   1） 初始含水率為60%的生物固體，經(jīng)微波輻照處理后，衛(wèi)生學(xué)檢測指標(biāo)（糞大腸桿菌菌群數(shù)的MPN值）可以達到農(nóng)用控制標(biāo)準(zhǔn)的要求。     2） 微波處理過程中，生物固體剛剛達到干熱殺菌控制的溫度時，其殺菌效果就已經(jīng)明顯比干熱殺菌效果好，證明微波殺菌過程中存在非熱效應(yīng)機制。     3） 微波是通過抑制或破壞微生物細(xì)胞內(nèi)與生物氧化、呼吸代謝及能量產(chǎn)生有關(guān)的酶的活性來導(dǎo)致細(xì)胞死亡的。