- cDNA合成和gDNA去除僅用20分鐘完成
- 有效去除基因組DNA,無需設計RNA特異性引物或探針
- 高特異性,即便是低豐度的轉錄本也能獲得高產量的cDNA
- 轉錄本的5' 和3' 端區(qū)域都可以進行cDNA 合成
For 50 x 20 ul reactions: 100 ul 7x gDNA Wipeout Buffer, 50 ul Quantiscript Reverse Transcriptase, 200 ul 5x Quantiscript RT Buffer, 50 ul RT Primer Mix, 1.9 ml RNase-Free Water
逆轉錄試劑盒組分確保高效、高靈敏的Real-Time RT-PCR
組分 | 優(yōu)點 |
gDNA Wipeout Buffer | 僅在real-time RT-PCR 中檢測RNA |
Quantiscript Reverse Transcriptase | 可用于廣泛RNA起始量(10 pg to 1 µg RNA),高特異性 |
Quantiscript RT Buffer | 可通讀困難模板 |
RT Primer Mix | 所有轉錄本區(qū)域合成cDNA, 甚至從5' 端區(qū)域 |
原理
為獲得準確的real-time RT-PCR基因表達分析結果,很重要的是僅擴增和檢測cDNA?;蚪MDNA的干擾可通過設計橫跨外顯子/外顯子邊界的引物或探針避免。盡管如此,在某些特殊情況下(如:cDNA來自一個單外顯子基因),起始RNA樣品必須無基因組DNA。
使用QuantiTect Reverse Transcription Kit,基因組DNA污染物可使用*的gDNA去除緩沖液迅速有效的去除(見圖:“高效去除基因組DNA,確保精確的Real-Time RT-PCR”)。因為純化RNA樣品后無需另外采用DNA酶消化,從而可節(jié)省時間和費用。并且也無需設計RNA特異性引物和探針。
CT values for IL12A (low expression) | CT values for IL1RN | |||
Input RNA (ng) | QIAGEN | Supplier AII | QIAGEN | Supplier AII |
1000 | 30.9 | 32.0 | 23.1 | 24.9 |
100 | 34.2 | 35.4 | 26.3 | 26.6 |
10 | 37.8 | 46.8 | 29.7 | 30.3 |
1 | N.D. | N.D. | 32.4 | 34.5 |
應用Real-time,兩步法RT-PCR 分析IL12A 和IL1RN,起始RNA量不同 。應用QuantiTect Reverse Transcription Kit 或來自供應商Supplier AII的試劑盒逆轉錄總 RNA 。在 ABI PRISM 7900 上應用的QuantiTect Probe PCR Kit 、IL12A或 IL1RN的 QuantiTect Gene Expression Assays 分析合成的。 應用凱杰試劑盒CT值較低,尤其中等豐度的基因IL12A(粗體),cDNA產量更高。N.D.:未檢測(Not detected)。
RT Primer Mix包含有特別優(yōu)化的oligo-dT和隨機引物的混合物,使cDNA合成可從RNA轉錄本的各個區(qū)域起始,甚至可從5'區(qū)域開始(見圖:“高靈敏度檢測12.5 kb 轉錄本5'區(qū)域的靶分子”)。相對于其他供應商提供的試劑盒來說,QuantiTect Reverse Transcription Kit為real-time PCR分析提供高產量的cDNA,無需考慮待擴增目標序列位于轉錄本的哪個區(qū)域。同時,QuantiTect Reverse Transcription Kit也確保了real-time RT-PCR結果更好的重復性。
操作流程
使用QuantiTect逆轉錄試劑盒可在20分鐘內去除基因組DNA和合成cDNA(見流程圖)。由于兩個反應均在同一孵育溫度并使用預混液構建反應,因此操作過程快速且方便。相反,供應商I提供的試劑盒操作需更多移液步驟且經常需要調整孵育溫度,因此需要更長時間和更多手動操作。
應用
QuantiTect Reverse Transcription Kit可從各種類型的起始樣品中合成cDNA以實現(xiàn)高效和高靈敏度的real-time RT-PCR,包括激光顯微切割樣品和活組織切片樣品。與其他供應商提供的試劑相比,QuantiTect Reverse Transcription Kit在檢測低豐度基因時具有更高的靈敏度(見圖:“Real-Time,兩步法RT-PCR精確度更高”)。
為獲得高特異性和高靈敏度的real-time RT-PCR結果,又避免耗時的反應步驟優(yōu)化過程,我們推薦QuantiTect Reverse Transcription Kit和其他QuantiTect產品聯(lián)合使用。包括經優(yōu)化的PCR反應預混液和即用型引物,使用SYBR Green染料法或序列特異性探針法進行 real-time RT-PCR。
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上海力敏實業(yè)有限公司代理qiagen產品,咨詢
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